一株牛瘤胃耐酸纤维素降解细菌的筛选、鉴定及酶学特性分析

马宁++魏姜勉++张亮

摘 要：通过对夏南牛瘤胃样本进行微生物富集培养，筛选、获得一株纤维素高效降解细菌ZJ08，分子鉴定确定该菌属于假黄单胞菌属，其纤维素酶活的最适温度为55℃，最适pH为5.0，是一株具有较强耐酸特性的纤维素降解菌株，具有潜在的应用价值。

关键词：假黄单胞菌；牛瘤胃；微晶纤维素；降解

中图分类号： 文献标识码：A 文章编号：1007-273X（2015）06-0007-02

反刍动物的瘤胃消化系统是一个小型的“纤维素降解发酵系统”，瘤胃中栖息着大量微生物，其中部分真菌和细菌可以分泌纤维素酶以辅助消化并吸收富含纤维素的饲料。因而瘤胃中纤维素降解微生物在新饲料研发、新能源开发及环境治理等方面有着潜在的应用价值。本研究从夏南牛瘤胃中分离到1株能够利用微晶纤维素的微生物，对其进行了鉴定和酶学特性研究。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂 微晶纤维素购自上海生工生物有限公司，CMC购自国药集团化学试剂公司。刚果红、（NH4）2SO4、 K2HPO4、 NaH2PO4、 MgSO4·7H2O、 NaCl、 NH4H2PO4、KCl、 蛋白胨、酵母提取物、牛肉浸膏等购自国内各生物试剂公司。引物EU8F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和EU1492R（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）由上海Sangon公司合成。DNA聚合酶、T4 Ligase、pMD-18T Vector购自TaKaRa大连公司。

1.1.2 培养基 LB培养基参照《分子克隆实验指南》中的配方。SX固体培养基：（NH4）2SO4 2.5 g，K2HPO4 2.0 g，NaH2PO4 1.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，微晶纤维素 5.0 g，琼脂 15.0 g，蒸馏水 1 000 mL，pH 7.4。

1.1.3 菌种 供试菌ZJ01至ZJ34等34个菌株由驻马店市兽药饲料（动物产品）质量检验监测中心提供。将-40℃保存的34个供试菌株在SX培养基中划线，置于28℃恒温培养活化。

1.2 方法

1.2.1 刚果红染色法 将待测菌株接种于SX固体培养基中，28 ℃下培养6 d后，用0.1%的刚果红溶液浸泡平板10 min，用0.85%的 NaCl水溶液漂洗15 min，观察平板上是否出现透明降解圈，以验证纤维素是否被有效降解。

1.2.2 菌种发酵及pH变化检测 用打孔器挑取经28 ℃活化培养5d的菌体5块，置于150 mL的SX液体培养基中，100 r/min，28 ℃下摇床培养，每隔24 h取5 mL上发酵液，10 000 r/min离心3 min后取上清液，计测定发酵液pH值，每个样品重复3次。

1.2.3 基因组DNA提取 挑取目标菌株单菌落接种于5 mL LB液体培养基中，120 r/min，28 ℃摇床培养过夜；5 000 r/min离心10 min收集沉淀，用0.85 % NaCl冲洗2次；将沉淀悬浮于0.5 mL 0.85% NaCl溶液中，每管加入0.4 μL100 mg/mL溶菌酶，37 ℃振荡1 h；加入40 μL 10% SDS水溶液，再加入25 μL 100 mg/mL的蛋白激酶K，37 ℃下震荡3～4 h，待溶液完全透明后，置于60 ℃下处理20 min，使蛋白酶失活；每管加入一倍体积的酚-氯仿，轻轻混匀，使蛋白质等杂质沉淀析出；15 ℃，5 000 r/min离心15 min。取上层液体移入1.5 mL离心管中，向管中加入1/10体积3 mol/L CH3COONa；缓慢加入2.5倍体积-20 ℃下预处理的无水乙醇，混匀后置于-80℃冰箱中冷冻30 min，取出后在4 ℃下12 000 r/min离心15 min；弃上清，向管中加入0.5 mL 的-20℃的70%乙醇溶液，4 ℃下12 000 r/min离心5 min，弃上清后于超净工作台中过夜干燥，加入适量的ddH2O 使DNA溶解，将DNA 置于-20℃冰箱中保存待用。

1.2.4 菌株16S rDNA扩增与测序 用原核生物通用引物EU8F和EU1492 R进行PCR扩增。PCR 反应体系总体积25 μL，扩增条件为：95 ℃ 4 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，30个循环；72 ℃延伸10 min。PCR产物经凝胶电泳检测及凝胶回收试剂盒纯化，克隆到pMD 18-T Vector，送上海生工生物工程有限公司进行测序。

1.2.5 CMCase 酶活力的测定 取培养6 d的CM液体发酵液，5 000 r/min离心10 min，取上清液作为粗酶液用于酶活测定。具体方法如下：吸取粗酶液0.2 mL，加入1.8 mL 1% （W/V）CMC-Na 的醋酸-醋酸钠缓冲液（pH 4.8），经50 ℃恒温水浴30 min 后， 按DNS法在540 nm下测定吸光值，换算还原糖生成量， 计算CMC 酶活。分别在不同温度、不同pH下测定CMC酶活。在酶反应体系中分别加入0.01 mol/L 的Ca2+、Mg2+、Zn2+、Fe2+、Cu2+、Mn2+、Hg2+ 和Pb2+等金属离子，测定其对纤维素酶活力的影响。

酶活单位按照国际单位规定定义为以每分钟催化纤维素水解产生1 μmol葡萄糖所需要的酶量为1个酶活力单位（U）。CMC酶活（U）=A×5×25×1000/30（μmol/mL·min）。

2 结果与分析

2.1 纤维素降解菌株的筛选

将34株供试菌活化后接种至SX固体培养基上，28 ℃条件下培养8 d，筛选出生长作为旺盛的ZJ08菌作为目标菌株，并对其进行刚果红染色，出现一个明显的无色透明圈。刚果红与纤维素等多糖结合形成刚果红-多糖复合物呈现红色，当多糖物质被降解后，刚果红则与之分离而脱色。

2.2 菌株发酵液pH值变化

将ZJ08菌接种于SX液体培养基中，于28 ℃，120 r/min下恒温培养，每24 h取样测定pH值。第三天，发酵液pH值开始迅速下降，第六天时pH降至2.30，随着发酵时间的继续增加，pH值开始回升。

2.3 菌株的分子鉴定

用原核生物通用引物EU8F和EU1492R对ZJ08菌株基因组DNA进行扩增、克隆并测序。测序结果与NCBI数据库BLAST比对，选取同源性较高的菌株，使用Mega 5.0软件的MCL（Maximum Composite Likelihood）法计算进化距离，用NJ（Neighbor-Joining）法和Bootstrap法产生1 000个聚类树，按照多数规则法（Majority-rule）得到了一个最“逼真”的系统发育树。ZJ08菌株属于假黄单胞菌属（Pseudoxanthomonas sp.），与对芳香烃物质间苯二酚具有较强降解能力的QQDP512菌株的同源性高达99%，与对有机杀菌剂百菌清具有很好降解能力的CTN-8菌株的同源性达99%。

2.4 酶学特性

2.4.1 酶的最适反应条件 在30～80 ℃范围内，分别测定不同温度下的酶活力。结果表明，ZJ08菌株的酶活力在45～65 ℃范围内均能保持较高水平的酶活，在55 ℃下酶活力最高，达到96.4 U/mL。

ZJ08粗酶液只在初始pH 4.0～6.0范围内具有较高活性，当pH值高于8.0或低于3.0，相对酶活仅有不到20%。

ZJ08菌株的酶活跟反应体系中的金属离子种类有直接联系。在Fe2+和Mn2+的作用下，相对酶活均提高100%以上；而Pb2+ 、Hg+、和Cu2+等重金属均可使酶活降低80%以上，对酶蛋白有强烈的抑制作用。

2.4.2 酶活热稳定性分析 将粗酶液分别置于55～85 ℃的温度范围内水浴处理30 min，于55℃下测定相对酶活，从而进行热稳定性研究。结果表明，当粗酶液于65～85 ℃高温处理30 min后，残留活力迅速下降至40%以下；60 ℃处理30 min后，酶活力下降至53%； 55 ℃处理30 min后，酶活力仍为100%。

3 讨论

本研究选用微晶纤维素为单一碳源，对从牛瘤胃中分离出34种微生物进行分离筛选，并获得一株纤维素高效降解菌ZJ08，通过分子生物学鉴定，确定该菌株属于假黄单胞菌属。这也是首次证明假黄单胞菌属菌株具有纤维素的能力。此外，该属的部分菌株对于一些复杂的有机化合物（如百菌清、间苯二酚）具有较好的降解作用，这从一定程度上说明了假黄单胞菌属对一些结构复杂的有机化合物有独特的降解能力。

ZJ08菌株具有较强的纤维素降解能力和独特的产酸特性，在畜禽饲料、化工原料生产及生态环保领域有着较高的利用前景。

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