基于网络药理学探讨桃仁-红花药对治疗膝骨性关节炎的作用机制

赖财荣 雷 升 窦志芳* 任锡禄

膝骨性关节炎（knee osteoarthritis, KOA）是一种退行性疾病，主要表现为多种致病因素作用下软骨细胞及细胞基质合成与分解的动态平衡被打破，从而导致膝关节软骨的破坏增生，继而导致关节间隙变窄，临床主要表现为关节疼痛、关节腔积液，甚至活动障碍；在最新的风湿协会关节炎管理指南中提到，KOA的治疗以缓解症状、减轻病情为主要手段，主要采用非甾体抗炎药及解热镇痛药等缓解患者的症状、透明质酸及氨基葡萄糖等药物来减缓病情的发展[1]；在疾病的后期甚至通过手术治疗KOA；长期服用西药不仅引起一系列身体损伤，而且价格昂贵；中医药治疗KOA有独特的优势，不仅廉价、不良反应少，疗效也可以保证[2-4]。

桃仁-红花药对出自《医宗金鉴》桃红四物汤。桃仁苦以泄滞血，红花辛散温通，活血通经，散瘀止痛，两药相须为用，一升一降，一散一收，活血祛瘀之力倍增，且有活血生新，消肿止痛之功。KOA属于中医“痹症”“痹病”的范畴。桃仁、红花药对已广泛应用于KOA治疗中，身痛逐瘀汤等治疗KOA的经典方剂中就包含桃仁、红花这一药对；但对这一药对治疗KOA的作用机制尚无系统阐述。网络药理学作为一个新兴学科，基于分子层面，通过数据的可视化分析，构建药物-有效成分-疾病-靶点网络来预测药物治疗疾病的作用机制。本研究基于网络药理学探讨桃仁-红花药对治疗KOA的作用机制，为中医药治疗KOA提供理论依据。

1 方法

1.1 筛选“桃仁-红花”有效成分和靶点

中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP, http://tcmspw.com/tcmspsearch.php），以“桃仁、红花”为药物名称，分别检索出相应药物的有效成分，并根据口服生物利用度（oral bioavailability, OB）以及类药性（drug likeindex, DL）对其进行筛选，OB是指药物被吸收进入人体循环的速度与程度；DL指的是化合物与已知药物的相似性。相关研究表明，OB＞30%具有较好的口服生物利用度，DL＞0.18具有较好的类药性[5]。本研究通过上述两个指标对药物有效成分进行筛选，得到符合标准的有效成分，并通过TCMSP数据库预测筛选后成分的作用靶点，再把预测的靶点基因导入到Uniprot数据库（http://www.uniprot.org/）进行基因标准化。

1.2 筛选KOA相关靶点基因

在药物作用靶点数据库（TTD，http://db.idrblab.net/ttd/），在线人类孟德尔遗传数据库（OMIM，http://www.omim.org/）和人类基因数据库（GeneCards，https://www.genecards.org/）网站输入“Knee osteo arthritis”为关键词进行检索，并下载相关的靶点信息，为了筛选出与疾病相关性高的靶点信息，故将GeneCards数据库检索的疾病靶点按Relevance score＞10进行整理，再将3个数据库得到的靶点基因合并。再导入Uniprot 数据库（http://www.uniprot.org/）进行基因标准化命名并删除重复值。

1.3 药物、疾病共同靶点的筛选及韦恩图的构建

将药物相关靶点基因和疾病靶点基因导入到微生信（http://www.bioinformatics.com.cn/）在线作图工具构建韦恩图，并得到药物与疾病的共同靶点。

1.4 蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络的构建

将药物与疾病的共同靶点基因数据导入String数据库（https://string-db.org/），物种设置成“Homo sapiens”（人类），选择高置信值0.700，删除游离蛋白，下载TSV数据文件，再将其导入Cytoscape 3.7.2软件进行可视化分析，利用Cytoscape的NeteworkAnalyzer工具计算出Degree值，根据Degree值筛选出核心基因。

1.5 药物-有效成分-疾病-靶点网络的构建

将药物有效成分、及药物相关靶点基因、药物与疾病交集靶点导入Cytoscape 3.7.2软件构建药物-有效成分-疾病-靶点网络，并通过NeteworkAnalyzer工具进行分析，得到各个节点的Degree值，并根据Degree得出核心的药物成分。

1.6 生物学功能与通路分析

将疾病与药物的交集靶点基因导入Metascape数据库（http://metascape.org），物种选择人类，进行基因本体（GO）富集分析和京都基因和基因组百科全书（KEGG）富集分析，设定标准为P值小于0.01、最小计数为3和富集因子大于1.5。运用微生信（http: //www.bioinformatics.com.cn/）在线作图工具将P-value最小的前20条结果制作成气泡图进行可视化分析。

2 结果

2.1 桃仁-红花药对化学成分生物口服利用度和类药性

共获得桃仁、红花有效成分45个，其中桃仁有效成分23个，红花有效成分22个。桃仁及红花有效成分生物口服利用度和类药性见表1。

表1 桃仁、红花有效成分生物口服利用度和类药性

2.2 桃仁-红花药对主要成分的预测靶点结果

得到桃仁相关的靶点基因252个，红花相关靶点基因436个，其中MOL001339、MOL001343、MOL001348、MOL001350、MOL001371、MOL002680、MOL002698、MOL002706、MOL002707、MOL002719未找到相应的靶点基因。最终得到桃仁-红花药对成分相关靶点基因为656个。

2.3 桃仁-红花药对与KOA交集靶点韦恩图

桃仁-红花药对的靶点基因共得到129个，KOA的靶点基因有518个，两者的交集靶点为43个。见图1。

图1 桃仁-红花药对与KOA交集靶点韦恩图

2.4 药物-疾病交集靶点PPI网络

药物-疾病交集靶点PPI网络中有节点39个，168条边。见图2。前10位核心基因分别为IL6、MAPK8、IL1B、MAPK1、JUN、VEGFA、PTGS2、CCL2、EGF、MMP2。

图2 桃仁-红花药对-KOA交集靶点PPI网络

2.5 药物-有效成分-疾病-靶点网络的构建

药物-有效成分-疾病-靶点网络340条边，80个节点，包括疾病节点1个，药物节点2个，基因节 点43个，桃仁成分节点18个，红花成分节点17个。得到Degree值排前5的有效成分分别为quercetin（槲皮素）、beta-sitosterol（beta-谷甾醇）、kaempferol（山奈酚）、luteolin（木犀草素）、baicalein（黄芩素），其Degree值分别为41、30、21、20、13。见图3。

图3 药物-有效成分-疾病-靶点网络

2.6 生物学功能与通路分析结果

结果共获得598条GO功能条目（P＜0.01），其中包括468条生物过程，87条细胞组分，43条分子功能。生物过程主要富集在炎症反应（inflammatory response），对伤害的反应（response to wounding），细胞迁移的正调控（positive regulation of cell migration），细胞运动的正调控（positive regulation of cell motility），细胞成分运动的正调控（positive regulation of cellular component movement）等。细胞组分主要富集在转移酶复合物（transferase complex）、核染色体（nuclear、chromosome）、囊腔（vesicle lumen）、泛素连接酶复合物（ubiquitin ligase complex）、cullin环泛素连接酶复合物（cullin-RING ubiquitin ligase complex）等。分子功能主要富集在丝氨酸型内肽酶活性（serine-type endopeptidase activity）、丝氨酸型肽酶活性（serine-type peptidase activity）、丝氨酸水解酶活性（serine hydrolase activity）、内肽酶活性（endopeptidase activity）、肽酶活性（peptidase activity）等。见图4～6。

图4 桃仁-红花药对治疗KOA靶点基因的生物过程结果

图5 桃仁-红花药对治疗KOA靶点基因的细胞组分结果

图6 桃仁-红花药对治疗KOA靶点基因的分子功能结果

2.7 KEGG信号通路富集分析结果

共获得KEGG信号通路121条，删除“cancer”相关通路，选择P-value值最小的前20条通路。与KOA相关的通路主要有糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路（AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications）、流体剪应力与动脉粥样硬化（Fluid shear stress and atherosclerosis）、IL-17信号通路（IL-17 signaling pathway）、恰加斯病（Chagas disease）、肿瘤坏死因子信号通路（TNF signaling pathway）。见图7。

图7 桃仁-红花药对治疗KOA靶点基因的KEGG信号通路

3 讨论

KOA属于中医“痹症”“痹病”的范畴，早在《黄帝内经》就对痹病有了较为详细的论述，如《素问·痹论》提出：“风、寒、湿三气杂至，合而为痹”，指出了痹症的病因病机为邪气侵袭，导致经络闭阻。《类证治裁·痹症》：“诸痹，风寒湿三气杂合，而犯其经络之阴也。风多则引注，寒多则掣痛，湿多则重着，良久营卫先虚，腠理不密，风寒湿乘虚内袭， 正气为邪气所阻，不能宣行，因而留滞，气血凝涩，久而成痹”；清代王清任的“瘀血致痹”理论中认为瘀血不止是痹症的产物，同时也是致病因素，主张活血化瘀为治疗基本原则。中医药治疗KOA历史悠久，具有独特的优势以及显著的疗效。孙壮等[6]的研究发现身痛逐瘀汤联合透化系统可以很好地降低相关炎症介质水平，抑制炎症反应，有效改善患者症状，相对于单纯透化治疗效果更明显。包杭生等[7]研究发现补阳还五汤可有效改善KOA患者的WOMAC评分，调节关节液中炎症介质，促进骨髓水肿的吸收，延缓软骨细胞的破坏和退变。补阳还五汤和身痛逐瘀汤都包含桃仁-红花药对，在治疗KOA方面取得了良好的效果。本研究基于网络药理学从成分、靶点、通路等角度揭示桃仁-红花药对治疗KOA的作用机制，为中医药治疗该疾病提供理论依据。

本研究筛选出桃仁-红花药对治疗KOA的主要成分为槲皮素、beta-谷甾醇、山奈酚、木犀草素、黄芩素等。槲皮素可以通过抑制核因子κB激活，减弱炎症环境下软骨细胞内MMP-13产生，降低MMP-13/TIMP-1比例，抑制软骨细胞外基质的降解和细胞凋亡，起到保护软骨的作用[8-9]，槲皮素也可以通过抑制TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-17等炎症介质和金属蛋白酶（MMP-3和MMP-9）的表达，以此改善KOA患者的症状[10]。相关研究发现，山奈酚通过抑制细胞内的MAPK和核因子KB通路活性，从而抑制IL-1β诱导的成纤维细胞（RASF）增殖、环氧化酶-2（COX-2）的表达与前列腺素E2（PGE2）的产生，且还可抑制TNF-α在成骨细胞中诱导信号的传导，从而减少IL-6和MCP-1的分泌，以此减轻滑膜炎症，同时还可通过抑制C-FOS的表达，阻断RANKL诱导破骨细胞的生成[11-12]。木犀草素可降低NLRP3炎性小体活化，减少血浆内IL-1β和IL-18水平，增强骨保护素的表达，减轻胶原激活炎症所导致的骨破坏[13]。黄芩素可通过抑制因IL-1β刺激而引起的caspase-3活化，提高Bcl-2表达量和抑制PARP裂解，从而对软骨细胞的凋亡起到保护作用，还可提高SOX-9的表达量，从而促进软骨细胞分泌细胞外基质（ECM），加强两者的相互作用，达到治疗KOA的目的[14]。

将药物-疾病交集靶点进行PPI网络分析，利用Cytoscape的NeteworkAnalyzer工具得出来的网络前10位核心基因，分别为IL6、MAPK8、IL1B、MAPK1、JUN、VEGFA、PTGS2、CCL2、EGF、MMP2等。推测桃仁-红花药对治疗KOA的作用机制可能与上述靶点基因密切相关。研究发现IL-1β可诱导产生IL-6，IL-6可以作用于B淋巴细胞，通过分泌形式作用于软骨细胞，抑制软骨细胞的分裂和蛋白聚糖的合成[15]，还可以增加滑膜组织中炎症细胞，使MMPs的表达增多，细胞外基质的合成与降解失衡[16]。刘丰等[17]的研究发现血管内皮生长因子（VEGF）可促进血管生成和增加血管通透性，是KOA发展过程中重要炎症介质，VEGF还通过影响MMPs与TIMPs，导致软骨细胞增殖与凋亡之间的平衡破坏，MMPs的增加使降解细胞外胶原和蛋白多糖的速度加快，加速了软骨细胞的破坏[18]。CCL2属于趋化性细胞因子，在炎症介质（IL-8，TNF等）刺激下，由单核细胞和巨噬细胞等产生，在成骨细胞、破骨细胞等表达，参与炎症反应[19-20]。相关研究发现，关节炎患者血清与滑膜液中的CCL2水平与疼痛水平和残疾程度正相关，CCL2优先介导单核细胞运输，促进了KOA的炎症反应与组织损伤[21]。崔冠军等[22]的研究发现COX-2能够诱导PGE2的产生，PGE2能够激活滑膜细胞中MMPs的产生，从而导致软骨细胞的降解、基质细胞的合成和软骨细胞的凋亡。王海英[23]的研究发现EGF对软骨细胞的凋亡具有保护作用。未发现JUN、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK1、MAPK8）与KOA的相关研究，因此可以作为新的研究方向。

通过药物-疾病交集基因进行富集分析发现，靶点基因主要富集在糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、流体剪应力与动脉粥样硬化、IL-17信号通路、恰加斯病、肿瘤坏死因子信号通路、癌症的途径、HIF-1信号通路等信号通路。IL-17信号通路中的IL-17A和IL-17R与靶细胞膜特异性受体结合，通过跨膜受体SEFIR内的信号转导分子ACT1，活化后的ACT1与TRAF6相结合，最终共同激活核因子κB等炎症通路[24]，进而导致了KOA症状的加重。TNF信号通路介导的炎症反应对KOA病情的发展起着重要作用，可通过促进CCL2、VEGF、IL-1β、TNF-α的表达，加重机体的炎症反应[25]。相关研究发现，HIF-1在炎症条件下被激活，具有调控免疫细胞的存活以及促炎症介质表达功能[26]，尤其是在炎症介质白细胞介素的合成中发挥重要作用，同时HIF-1还能促进VEGF的生成，进而通过影响MMPs与TIMPs来促进软骨细胞的凋亡[27]。糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、流体剪应力与动脉粥样硬化、恰加斯病、癌症的途径等通路未发现有与KOA相关研究，但不排除这些通路与KOA的关系，如需进一步了解，可作为新思路进行研究。

综上所述，本研究通过网络药理学的方式得出桃仁-红花药物有效成分通过多靶点，多通路产生抑制KOA内的炎症反应、成骨细胞的表达、软骨细胞凋亡等作用，进而达到治疗KOA的目的。虽然本研究通过网络药理学验证了中医药治疗KOA有效，但因过程中通过不同数据库，不同数据库的相关算法不相同，对该结果还需要后期试验的验证。