皖南蝮蛇毒通过血小板抑制肿瘤转移的研究

李昱彤，孙 瑶，赵丽虹，刘啸宇，陈 磊

(皖南医学院 1.药学院；2.病理生理学教研室；3.麻醉学院，安徽 芜湖 241002)

乳腺癌一直是国内肿瘤研究关注的重点[1]，血小板在肿瘤转移中作用显著，C型凝集素受体2(C-type lectin-like receptor-2，CLEC-2)是血小板表面的活化受体[2]，也是肿瘤细胞表面平足蛋白(Podoplanin，PDPN)的体内受体[3]，两者结合后引起血小板活化聚集增多[4]。马来蝮蛇毒蛋白(Aggretin)能促进血小板聚集，抑制肿瘤细胞与血小板的结合从而抑制肿瘤转移[5]。安徽南部地区的皖南蝮蛇毒中含有促血小板聚集组分，前期研究发现该组分具有抑制肿瘤的作用，但机制尚不清楚。本研究通过筛选皖南蝮蛇毒中具有促血小板聚集的组分，建立血小板与乳腺癌细胞MCF-7共培养体系，进行细胞增殖检测、PDPN和P选择素的浓度检测，探索蝮蛇毒促血小板聚集组分抑制乳腺癌细胞的作用机制。

1 材料与方法

1.1 药物及试剂 皖南蝮蛇毒蛋白冻干粉源自皖南地区蝮蛇毒的分离纯化，依据280 nm条件下洗脱曲线的5个峰值分别得到蛇毒蛋白组分Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ，由皖南医学院蛇伤蛇毒研究所提供。DMEM高糖液体培养基购自美国Gibco公司，批号：8120470。CCK-8试剂盒购自北京兰杰柯科技有限公司，批号：Biosharp BS350B。大鼠P选择素酶联免疫试剂盒购自上海酶联生物科技有限公司，批号：mlbi-ml28431-C。人平足蛋白酶联免疫试剂盒购自上海酶联生物科技有限公司，批号：mlbio-ml509818-C。

1.2 主要器材 蛋白质纯化系统购自美国GE公司，型号：AKTA Purifier。倒置荧光生物显微镜购自日本奥林巴斯公司，型号：IX51,DP72,cell sens。低速台式离心机购自上海安亭科学仪器厂，型号：TDL-50B。血小板聚集仪购自美国海伦娜公司，型号：AGGRAM。多功能酶标仪购自美谷分子仪器有限公司，型号：SpectraMax M2E。

1.3 动物及细胞 SD雄性大鼠，8～10周龄，体质量230～260 g，由长沙市天勤生物技术有限公司提供，生产许可证号：SCXK(湘)2014-011。人乳腺癌细胞株MCF-7由皖南医学院中心实验室提供。

1.4 蛇毒蛋白筛选 各组分蛇毒蛋白冻干粉用0.01 mol/L PBS溶解至浓度为1 mg/mL，相应编号Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ，分别检测对血小板聚集率的影响。

大鼠腹腔注射10%水合氯醛进行麻醉，腹部备皮消毒后腹主动脉采血，用含有3.8%枸橼酸钠的抗凝管收集血液。血液标本混匀后以3 000 r/min离心5 min，取上层血清为富血小板血清(prp)，取6份225 μL prp至石英杯，分别编号control group、Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ，control group注入8 μL生理盐水，其余分别注入8 μL相应编号蛇毒蛋白组分，37℃条件下孵育5 min。继续取prp标本以3 000 r/min离心10 min为乏血小板血清(ppp)，取ppp 250 μL至石英杯预热后检测ppp吸光值，待prp标本孵育结束后注入5 μmol/L二磷酸腺苷，检测吸光值后记录最大聚集率。

1.5 细胞培养

1.5.1 MCF-7细胞培养 乳腺癌细胞株MCF-7在含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基中培养，在37℃、5%CO2的细胞培养箱中孵育。

1.5.2 血小板与MCF-7共培养 选择对数生长期的MCF-7细胞接种于96孔板。以Aghaloo法[6]提取大鼠血小板，调节浓度约5.0×106个/mL，待MCF-7贴壁生长后加入。按照所加蛇毒蛋白的浓度分为对照组(0 μg/mL)、1号蛇毒蛋白组(3.125 μg/mL)、2号蛇毒蛋白组(6.25 μg/mL)、3号蛇毒蛋白组(12.5 μg/mL)、4号蛇毒蛋白组(25 μg/mL)，与血小板共同孵育24 h后进行形态学观察。

1.6 细胞增殖率检测 控制96孔板中MCF-7细胞约5 000个，贴壁生长后加入5.0×106cells/mL血小板及上述5组浓度的蛇毒蛋白各10 μL，孵育24 h后避光加入CCK-8溶液，2 h后在450 nm处检测吸光值。

1.7 蛋白指标检测 血小板与MCF-7细胞在96孔板中共培养4 h，每孔分别加入相应蛇毒蛋白10 μL，孵育24 h后取上清液。选择人平足蛋白酶联免疫吸附测定试剂盒检测人乳腺癌细胞MCF-7的PDPN浓度。选择大鼠P选择素酶联免疫分析试剂盒检测大鼠血小板的P选择素浓度。

2 结果

2.1 促进血小板聚集蛇毒组分的筛选 经实验探索得出血小板聚集率分析实验中蛇毒蛋白最佳剂量为8 μL，最佳孵育时间为5 min。结果显示，各组间血小板最大聚集率差异均有统计学意义(P<0.01)，且蛇毒蛋白组分Ⅱ干预的血小板最大聚集率高于对照组(P<0.01)，表明蛇毒蛋白组分Ⅱ促进血小板聚集。见表1。

表1 蛇毒蛋白各组分诱导血小板最大聚集率分析

2.2 血小板与MCF-7共培养体系形态学变化

2.2.1 血小板与肿瘤细胞共培养 如图1所示，血小板与MCF-7共培养后，在光学显微镜下可观察到血小板聚集于人乳腺癌细胞MCF-7表面，并且形成多个血小板与肿瘤细胞共同结合的细胞团块。

A.10×荧光倒置显微镜；B.40×荧光倒置显微镜。

2.2.2 皖南蝮蛇毒蛋白组分Ⅱ对共培养体系的影响 共培养4 h后加入蛇毒蛋白10 μL。如图2所示，随着组分Ⅱ浓度的增加，细胞聚集团块数减少，死亡细胞数量增多。

2.3 不同浓度皖南蝮蛇毒蛋白组分Ⅱ干预后MCF-7细胞增殖活力变化 CCK-8结果显示，在血小板与MCF-7细胞的共培养体系中，随蛇毒蛋白组分Ⅱ浓度的增大，细胞增殖活力逐渐下降，但差异无统计学意义(P>0.05)，见表2。

A.添加10 μL PBS;B.添加10 μL 3.125 μg/mL蛇毒蛋白组分Ⅱ;C.添加10 μL 6.25 μg/ml蛇毒蛋白组分Ⅱ;D.添加10 μL 12.5 μg/mL蛇毒蛋白组分Ⅱ;E.添加10 μL 25 μg/mL蛇毒蛋白组分Ⅱ。10×荧光倒置显微镜下。

2.4 皖南蝮蛇毒蛋白组分Ⅱ对培养上清中PDPN水平的影响 各组干预24 h后ELISA结果表明，与对照组比较，1、2号蛇毒蛋白组PDPN含量降低，但差异无统计学意义(P>0.05)；而3、4号蛇毒蛋白组PDPN含量均降低(P<0.05)，见表2。

2.5 皖南蝮蛇毒蛋白组分Ⅱ对培养上清中P选择素水平的影响 各组干预24 h后ELISA结果表明，与对照组比较，1、2号蛇毒蛋白组P选择素含量增高，但差异无统计学意义(P>0.05)；而3、4号蛇毒蛋白组P选择素含量均增高(P<0.05)，见表2。

表2 不同浓度皖南蝮蛇毒蛋白组分Ⅱ对肿瘤细胞增殖活力、PDPN浓度、P选择素浓度的影响

3 讨论

肿瘤细胞的生长依赖肿瘤微环境，通过与机体多种细胞结合促进增殖和迁移[7]，其中血小板的变化和恶性肿瘤的预后密不可分，通过CLEC-2与肿瘤细胞表面PDPN结合后累积活化[4]，聚集在肿瘤细胞团块周围，促进肿瘤的生长和转移。血小板表面CLEC-2与肿瘤细胞表面PDPN可作为抑制肿瘤转移研究的重要切入点。

P选择素在血小板静息状态下包裹在血小板细胞质的α颗粒内[8]，血小板活化时随α颗粒内容物释放被迅速又持久地表达在活化的血小板表面[9]，该表达不被血浆蛋白掩盖也不因时间的推移消失，故本研究以P选择素分泌水平反映血小板活化聚集程度。

据报道[10]，中国乳腺癌患者的发病率与病死率一直高于世界平均水平并持续增长，其转移多见淋巴道转移，研究[3]发现淋巴管内皮细胞表达的PDPN通过促进肿瘤淋巴管的生成促进肿瘤细胞的淋巴结转移[11]，PDPN的缺失显著抑制肿瘤淋巴管的生成，减少肿瘤的远处转移[12]。

研究[5]表明CLEC-2是Aggretin的一种血小板表面受体，抑制肿瘤转移并促进血小板的活化聚集，且它们的亲和力高于PDPN与CLEC-2的亲和力。本研究发现与马来蝮蛇同属的皖南蝮蛇，其蛇毒中蛋白组分Ⅱ可促进血小板聚集并抑制肿瘤增殖。故本课题建立共培养模型，探讨皖南蝮蛇毒蛋白组分Ⅱ对共培养体系的影响及可能机制。

本研究在显微镜下发现血小板明显黏附聚集于乳腺癌细胞表面。CCK-8结果显示随皖南蝮蛇毒蛋白组分Ⅱ浓度的增大，共培养体系中MCF-7的增殖率逐渐降低，但趋势不明显(P>0.05)，考虑可能由于共培养体系中血小板的存在对MCF-7增殖情况的检测造成干扰，导致对蛇毒蛋白浓度的变化不够敏感。ELISA结果显示PDPN水平随蛇毒蛋白组分Ⅱ浓度增高，与对照组比较，1、2号蛇毒蛋白组PDPN含量降低不明显(P>0.05)，而3、4号蛇毒蛋白组PDPN含量均降低(P<0.05)，提示在10 μL剂量条件下浓度为12.5 μg/mL的蛇毒蛋白组分Ⅱ是抑制MCF-7细胞分泌PDPN的最小剂量；P选择素分泌水平随蛇毒蛋白组分Ⅱ浓度增高，与对照组比较，1、2号蛇毒蛋白组P选择素含量增高不明显(P>0.05)，而3、4号蛇毒蛋白组P选择素含量均增高(P<0.05)，提示在10 μL剂量条件下浓度为12.5μg/mL是蛇毒蛋白组分Ⅱ促进血小板细胞分泌P选择素的最小剂量。皖南蝮蛇毒蛋白组分Ⅱ加入共培养体系后，MCF-7细胞PDPN的表达减少，而血小板的P选择素分泌增多，提示皖南蝮蛇毒蛋白组分Ⅱ与CLEC-2的亲和力大于PDPN与CLEC-2的亲和力。

综上所述，促进血小板聚集的皖南蝮蛇毒蛇蛋白组分Ⅱ抑制乳腺癌细胞MCF-7增殖的机制与其结合CLEC-2的能力大于PDPN结合CLEC-2的能力有关。这为进一步研究蛇毒蛋白抑制恶性肿瘤的转移奠定了理论基础。