miR-147b-5p对人髓核细胞退变的影响

张坤 勘武生 赵胜豪 马中希 黄梓君 李鲲

(1武汉市第四医院，湖北 武汉 430000；2湖北中医药大学)

腰椎间盘退行性病变常伴随有椎间盘突出症和(或)退行性腰椎滑脱症，该病具有高发病率，且其护理成本较高〔1，2〕。腰椎间盘在骨骼发育成熟时易发生退变的特征解释了约40%人类腰疼痛病例的病因，虽然疼痛可有效抑制，但有必要探索从根本上解决腰椎间盘退行性病变的新疗法〔3〕。miR-147b-5p参与了多种癌症的发生发展过程〔4，5〕，研究显示〔6〕，miR-147b在人正常和退变的腰椎间盘髓核组织间存在表达差异，在退变髓核组织中表达下调。利用靶基因预测网站分析发现，miR-147b-5p与Notch4存在结合位点，而Notch信号通路与退变的髓核细胞关系密切〔7，8〕。推测miR-147b-5p可能参与了髓核细胞的退变过程。炎性细胞因子是椎间盘退变的主要原因之一，通过白介素(IL)-1β和肿瘤坏死因子(TNF)-α可诱导人髓核细胞(HNPCs)构建腰椎间盘退变体外模型〔9〕。本研究通过IL-1β和TNF-α诱导HNPCs退变模型，观察miR-147b-5p对HNPCs退变的影响。

1 材料与方法

1.1细胞、试剂与仪器 细胞：HNPCs购自赛百慷(上海)生物技术股份有限公司。主要试剂：DMEM购自美国Hyclone公司；胎牛血清购自美国Gibco公司；磷酸盐缓冲液(PBS)、胰蛋白酶、甲苯胺蓝染色液(1%)、牛血清白蛋白(BSA)封闭液(5%)、Triton X-100、抗荧光淬灭封片液(含DAPI)、噻唑蓝(MTT)溶液、RIPA裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒均购自北京索莱宝科技有限公司；重组人IL-1β、TNF-α购自美国Pepro Tech公司；兔抗Ⅱ型胶原蛋白(Col Ⅱ)抗体、兔抗Notch4抗体、兔抗Hes5抗体、兔抗Hey1抗体、兔抗Hey2抗体、兔抗GAPDH抗体及二抗购自武汉贝茵莱生物技术有限公司；Trizol购自美国Ambion公司；SYBR FAST聚合酶链反应(PCR) Master Mix购自美国KAPA Biosystems公司；二甲基亚砜购自美国Sigma公司；膜联蛋白V异硫氰酸荧光素(AnnexinV-FITC)/碘化丙啶(PI)凋亡检测试剂盒购自美国BD公司；PVDF膜、化学发光试剂购自美国Millipore公司；PCR引物由武汉天一辉远生物科技股份有限公司合成。主要仪器：倒置荧光显微镜购自德国徕卡公司；荧光定量PCR仪购自美国Bio-Rad公司；高速冷冻离心机、酶标仪购自杭州奥盛仪器有限公司；流式细胞仪购自艾森生物(杭州)有限公司；全自动化学发光分析仪购自上海天能科技有限公司。

1.2细胞复苏与培养 将HNPCs从液氮罐中取出，37℃水浴至冻存液完全融化，将细胞悬液转移至离心管中，393 r/min离心3 min，弃上清。加入1 ml DMEM重悬细胞，转移至培养瓶中，再加入4 ml含10%胎牛血清的DMEM，放置于恒温培养箱(37℃，5% CO2)中培养。待80%以上的细胞汇合时进行传代，按照1∶2进行传代培养。

1.3髓核细胞退变模型构建〔9〕收集HNPCs，调整细胞密度制作单细胞悬液，并接种于12孔板中，每孔1 ml，约1×105个细胞/孔，培养过夜。将细胞分为对照组和模型组，对照组更换为正常培养基，模型组培养基中加入10 ng/ml IL-1β和25 ng/ml TNF-α，继续培养24、48 h。取出细胞培养板进行模型鉴定实验，根据鉴定结果筛选合适的诱导时间。

1.4甲苯胺蓝染色观察细胞内蛋白聚糖表达水平 采用20%的乙醇溶液稀释获得0.1%甲苯胺蓝染色液。弃细胞孔板中的培养液，PBS清洗后，加入1 ml 95%的乙醇溶液固定30 min。PBS清洗2次，加入1 ml甲苯胺蓝染色液染色10 min，PBS清洗2次后于显微镜下观察并拍照。

1.5免疫荧光染色观察细胞Col Ⅱ表达水平 取出各组细胞孔板，弃培养液，PBS清洗2次，加入1 ml 4%多聚甲醛室温固定30 min。PBS清洗2次，加入1 ml 0.5% Triton X-100室温通透20 min。PBS清洗2次，加入1 ml 5% BSA封闭液，室温封闭1 h。弃封闭液，加入Col Ⅱ抗体(1∶200稀释)，4℃孵育过夜。PBS清洗2次，加入二抗(1∶200稀释)，37℃孵育1 h。PBS清洗2次，加入300 μl抗荧光淬灭封片液(含DAPI)，于荧光显微镜下观察并拍照。

1.6实时荧光定量(qRT)-PCR检测细胞中miR-147b-5p的表达 分别收集对照组和模型组细胞约1×106个，Trizol提取总RNA，然后反转录合成cDNA，以cDNA为模板进行PCR扩增，反应程序：95℃，3 min；95℃，5 s，56℃，10 s，72℃，25 s，共40个循环。引物序列：miR-147b-5p正义链：5′-GGGTGGAAACATTTCTG-3′，反义链：5′-AACTGGTGTCGTGGAGTCGGC-3′；U6正义链：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，反义链：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。以U6为内参基因，采用2-ΔΔCt法计算细胞中miR-147b-5p的相对表达量。

1.7miR-147b-5p mimic及inhibitor瞬时转染细胞 收集退变的HNPCs，将其分为模型组、miR-147-5p mimic组、miR-147b-5p inhibitor组、mimic-NC组和inhibitor-NC组。转染前24 h，将5×105个细胞接种于2 ml培养基中，分布于6孔板，待细胞融合度达90%时进行转染。取100 pmol miR-147b-5p mimic或inhibitor(或对应的NC)稀释于250 μl Opti-MEM中，轻轻混匀。取5 μl Lipofectamine®RNAiMAX稀释于250 μl Opti-MEM中，轻轻混匀后静置5 min。将上述2种稀释液混合，室温孵育20 min。将混合液滴加于细胞培养板中，轻轻摇晃后置于培养箱中培养。转染4 h后更换新鲜培养基，培养24 h后检测各组细胞miR-147b-5p表达情况，检测实验同1.6。

1.8实验分组及处理 实验分为对照组、模型组、miR-147-5p mimic组、miR-147b-5p inhibitor组、mimic-NC组和inhibitor-NC组。对照组和模型组细胞正常培养，miR-147-5p mimic组、miR-147b-5p inhibitor组、mimic-NC组和inhibitor-NC组分别进行对应的转染实验，24 h后，除对照组继续正常培养外，其他5组均采用10 ng/ml IL-1β和25 ng/ml TNF-α诱导48 h构建髓核细胞退变模型。

1.9MTT法检测细胞活力 收集各组细胞，调整细胞悬液密度，分布于96孔板中，每孔100 μl，3×103个细胞/孔，于培养箱中培养过夜，待细胞贴壁。按照1.8分组处理，转染24 h，诱导48 h。取出培养板，每孔加入10 μl MTT溶液(5 mg/ml)，培养4 h。弃上清，每孔加入150 μl二甲基亚砜，低速振荡10 min。酶标仪检测各孔于490 nm处的吸光值。

1.10流式检测细胞凋亡 收集各组约1×106个细胞(分组处理同1.8)，400 r/min离心5 min。弃上清，加入1 ml PBS重悬细胞沉淀，400 r/min离心5 min。弃上清，加入200 μl PBS重悬，依次加入10 μl Annexin V-FITC和10 μl PI，轻轻混匀，4℃避光孵育30 min。加入300 μl PBS，于流式细胞仪中检测各组细胞凋亡水平。

1.11髓核细胞退变检测 收集各组细胞(分组处理同1.8)，甲苯胺蓝染色观察细胞内蛋白聚糖表达实验操作同1.4，免疫荧光染色观察细胞Col Ⅱ表达实验操作同1.5节。

1.12Western印迹检测Notch4、Hes5、Hey1及Hey2蛋白表达水平 收集各组细胞(分组处理同1.8)，按照每1×106个细胞加入200 μl裂解液的比例裂解细胞，提取细胞总蛋白。二喹啉甲酸(BCA)法测定蛋白浓度，以20 μg蛋白上样量进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离。采用湿转法将蛋白转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，室温封闭2 h。分别进行Notch4、Hes5、Hey1、Hey2及GAPDH抗体(稀释比均为1∶1 000)孵育，4℃过夜。PBS清洗后，进行二抗(1∶20 000稀释)孵育，室温1 h。PBS洗膜，滴加化学发光试剂，于全自动化学发光分析仪中检测，读取蛋白条带灰度值计算相对表达量。

1.13统计学处理 采用SPSS23.0软件进行t检验、单因素方差分析。

2 结 果

2.1髓核细胞退变模型鉴定 甲苯胺蓝染色结果(图1)显示，对照组正常髓核细胞多为类圆形或多角形，排列紧密，呈典型的集落样生长，细胞质内的蛋白聚糖被染成蓝色，细胞核呈圆形且深染；模型组细胞肿胀，细胞形态出现纺锤形，细胞质染色淡且不均匀，细胞核呈不规则形，符合髓核细胞退变时蛋白聚糖减少的特征。免疫荧光染色结果(图2)显示，对照组正常髓核细胞绿色荧光颗粒明显多于模型组，且细胞核染色更深，即退变髓核细胞中Col Ⅱ表达明显减少。由于48 h两组细胞间蛋白聚糖和Col Ⅱ表达差异比24 h的效果更好，因此本研究构建髓核细胞退变模型采用10 ng/ml IL-1β和25 ng/ml TNF-α诱导48 h。

图1 甲苯胺蓝染色观察HNPCs蛋白聚糖表达(×200)

图2 免疫荧光染色观察HNPCs Col Ⅱ表达(×200)

2.2髓核细胞中miR-147b-5p表达水平比较 与对照组(1.001±0.067)比较，模型组细胞中miR-147b-5p表达水平(0.320±0.05)明显降低(P<0.05)。说明髓核细胞退变时miR-147b-5p表达下调。

2.3转染效率检测 与模型组(1.003±0.094)比较，miR-147b-5p mimic组细胞中miR-147b-5p表达水平(3.005±0.106)显著上调，而miR-147b-5p inhibitor组(0.312±0.035)显著下调(均P<0.05);mimic-NC组和inhibitor-NC组(0.943±0.219、0.886±0.064)均无明显差异(P>0.05)，证明本研究成功获得miR-147b-5p表达上调(或下调)的退变髓核细胞。

2.4miR-147b-5p对退变髓核细胞活力的影响 MTT检测各组HNPCs活力(OD值)，与对照组(0.686±0.011)比较，模型组细胞活力(0.630±0.004)显著减弱(P<0.05)；与模型组比较，miR-147b-5p mimic组细胞活力(0.664±0.012)显著增强，而miR-1476-5p inhibitor组细胞活力(0.602±0.008)显著减弱(P<0.05)，mimic-NC组、inhibitor-NC组细胞活力(0.625±0.013、0.631±0.018)均无显著差异(P>0.05)。

2.5miR-147b-5p对退变髓核细胞凋亡的影响 流式检测各组HNPCs凋亡率，与对照组〔(5.337±0.577)%〕比较，模型组细胞凋亡率〔(7.423±0.267)%〕显著升高(P<0.05)；与模型组比较，miR-147b-5p mimic组细胞凋亡率〔(5.017±0.548)%〕显著降低，miR-1476-5p inhibitor组细胞凋亡率〔(11.223±0.540)%〕显著升高(P<0.05)；mimic-NC组及inhibitor-NC组〔(7.697±0.410)%、(8.030±0.046)%〕均无显著差异(均P>0.05)。见图3。

图3 流式检测每组HNPCs凋亡

2.6miR-147b-5p对退变髓核细胞蛋白聚糖及Col Ⅱ表达的影响 甲苯胺蓝染色结果及免疫荧光染色结果显示，模型组HNPCs中蛋白聚糖及Col Ⅱ表达明显少于对照组；与模型组相比，miR-147b-5p mimic组HNPCs中蛋白聚糖及Col Ⅱ表达明显增多，miR-147b-5p inhibitor组及inhibitor-NC组均明显减少。见图4、5。

图4 甲苯胺蓝染色观察各组HNPCs中蛋白聚糖的表达(×200)

图5 免疫荧光染色观察各组HNPCs Col Ⅱ表达(×200)

2.7miR-147b-5p对退变髓核细胞中Notch信号通路相关蛋白表达的影响 与对照组比较，模型组细胞中Notch4、Hes5、Hey1及Hey2蛋白表达水平均显著升高(均P<0.01)；与模型组比较，miR-147b-5p mimic组Notch4、Hes5、Hey1及Hey2蛋白表达显著减少(P<0.01)，而miR-147b-5p inhibitor组各蛋白表达水平均显著升高(均P<0.01)。见表1、图6。

表1 HNPCs中Notch4、Hes5、Hey1及Hey2蛋白相对内参GAPDH蛋白的表达

1～6：对照组、模型组、miR-147b-5p mimic组、miR-147b-5p inhibitor组、mimic-NC组、inhibitor-NC组图6 Western印迹检测HNPCs中Notch4、Hes5、Hey1及Hey2蛋白表达

3 讨 论

腰痛是一种常见的骨科疾病，研究证实椎间盘退变是引起腰痛的主要原因之一〔10〕。研究发现，椎间盘退变过程涉及椎间盘结构损伤和细胞数量及组成发生改变等〔11〕。髓核的结构和生化成分发生改变，蛋白聚糖、水分含量的下降致使椎间盘承载能力降低，胶原成分的改变及含量下降导致其弹性逐渐丧失，即为椎间盘髓核退变的过程〔12〕。本研究发现细胞中蛋白聚糖及Col Ⅱ表达均降低，符合髓核细胞退变的病理特征〔13，14〕，即本研究成功诱导了髓核细胞退变模型。目前，针对椎间盘退变的治疗方法仍以保守治疗和手术治疗为主，可缓解症状，然而并未对椎间盘退变进行病因治疗〔12〕。对退变的髓核细胞进行生物学再生修复方案，如基因治疗、细胞治疗、生长因子注射治疗等〔15〕，将为椎间盘退变的治疗提供更多可能。miRNA通过靶向mRNA调节基因的表达，参与了多种病理生理过程，包括退行性肌肉骨骼病理〔16〕。有研究发现〔17〕，miR-202-5p在退行性髓核细胞中低表达，抑制miR-202-5p表达可增加自噬相关蛋白的表达，促进退变髓核细胞的自噬及凋亡。Chen等〔18〕也认为椎间盘退行性病变与miRNA的调节异常有关，并发现miR-24-3p在退行性髓核细胞中表达水平升高，且其表达与椎间盘退变的程度呈正相关，可诱导髓核细胞凋亡。

Notch信号通路是一条高度保守的信号转导途径，包括4个家族成员(Notch1，2，3，4)，调节多种致病过程，其调控作用对骨骼发育代谢具有重大的意义，同时，Notch信号通路在退变髓核细胞的修复重建中也扮演着重要角色〔7〕。当促炎细胞因子介导髓核细胞退变时，髓核细胞发生代偿机制，Notch信号通路被激活促进细胞增殖从而补偿退变丧失的细胞数量〔8〕。但也有研究发现抑制Notch1基因的表达可促进间充质干细胞转化为髓核样细胞中蛋白聚糖及Col Ⅱ的表达，认为对Notch1基因表达进行抑制可提高椎间盘髓核细胞的生物活性〔19〕。本研究结果显示，上调退变髓核细胞中miR-147b-5p表达，可抑制Notch4及其靶基因Hes5、Hey1和Hey2〔20〕表达。结合本次研究结果及上述研究，可推测炎性细胞因子引起的Notch信号通路激活在退变髓核细胞中的代偿机制具有一定的限度，也可能是由于miR-147b-5p并不是通过Notch信号通路维持退变髓核细胞的数量及生物活性。

综上，miR-147b-5p在退变髓核细胞中表达降低，增加其表达水平可恢复退变髓核细胞的生物学活性，但其具体作用机制是否与Notch信号通路相关还有待进一步验证。