BDNF失平衡与中老年T2DM患者葡萄糖代谢和认知损害相关性

熊静 李舒婷 邢维昊 张晓琳 刘凤 巫晓宇

(昆明医科大学第二附属医院神经内科，云南 昆明 650101)

2型糖尿病(T2DM)、认知功能障碍和痴呆是非常普遍的慢性疾病，60岁以上的T2DM患者中痴呆比例高达20%〔1〕。T2DM与阿尔茨海默病(AD)、血管性痴呆和轻度认知障碍的病程进展有关〔2〕。值得注意的是，糖尿病也是痴呆患者的常见共病，痴呆患者合并糖尿病的比例为13%～39%〔3〕，而认知障碍也会恶化T2DM的管理。到2050年，预计中国痴呆患者将达到4 000万〔4,5〕。由于糖尿病和认知障碍间的密切联系，在今后的10～15年间，糖尿病对痴呆发病率的影响将日趋明显〔6〕。

脑源性神经营养因子(BDNF)在大脑不同区域合成和表达〔7〕，也存在于周围神经淋巴细胞、内分泌系统、胰腺、内皮细胞和脂肪组织中〔8,9〕。BDNF在T2DM胰岛素抵抗和认知障碍中有重要作用〔10，11〕，BDNF参与调节葡萄糖代谢和胰岛素抵抗，参与胰岛素信号通路激活，包括磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B(Akt)等〔11〕。BDNF与神经元存活、突触可塑性、学习和记忆密切相关。BDNF在内质网中先合成BDNF前体蛋白(proBDNF)，proBDNF在细胞内和细胞外经过一系列蛋白酶剪切形成成熟型BDNF(mBDNF)〔7,12〕。近年来的研究表明，proBDNF/mBDNF通路平衡对神经元可塑性和持续更新有重要作用，proBDNF和mBDNF失平衡，与AD、血管性痴呆、帕金森病等神经变性疾病密切相关〔12,13〕。mBDNF分泌减少和proBDNF增加是AD和抑郁的共同致病因素〔14〕。本课题组的前期研究〔15〕采用高脂饮食喂养C57BL/6小鼠诱导建立T2DM的小鼠模型，小鼠脑内proBDNF上调，与血糖水平和与小鼠记忆损伤呈负相关；小鼠脑内mBDNF下调，与血糖水平和小鼠记忆损伤呈负相关，提示proBDNF和mBDNF失平衡是T2DM认知损伤的可能机制。

研究发现肥胖、T2DM、痴呆患者血浆中BDNF表达水平降低〔16〕。Passaro等〔17〕注意到T2DM和痴呆患者组的血浆BDNF水平显著低于非糖尿病痴呆患者组。T2DM损害学习和记忆的部分原因是通过下调BDNF表达，改变了突触可塑性〔18〕。目前还没有研究报道T2DM患者血浆中内proBDNF和mBDNF改变与T2DM认知损伤的关系。本研究分析proBDNF和mBDNF与T2DM患者胰岛素抵抗、炎性反应和认知损伤的相关性。

1 材料与方法

1.1研究对象 选取2019年12月至2020年12月就诊于昆明医科大学第二附属医院神经内科的患者，年龄≥45岁，性别不限，T2DM诊断根据《中国2型糖尿病防治指南》〔19〕。采用蒙特利尔认知评定(MoCA)量表进行总体认知功能筛查，MoCA<26分，认为有认知损害。根据有无T2DM和认知障碍，分为3组：对照组(无T2DM+无认知障碍)39例、T2DM组26例、T2DM伴有认知障碍组27例。排除大面积脑梗死、脑出血、中枢神经系统脱髓鞘疾病、脑肿瘤、脑外伤、神经梅毒、获得性免疫缺陷综合征(艾滋病)患者。排除甲状腺疾病、甲状旁腺疾病及维生素及其他元素缺乏症。排除精神分裂症、酒精及药物滥用。排除本研究开始1个月内使用过影响认知功能的药物。排除合并感染、严重的循环、呼吸、泌尿、消化、造血系统疾病及恶性疾病者。排除视听障碍不能完成检查者。排除冠心病和高血压患者。3组年龄、性别构成、受教育年限无显著差异(P>0.05)。见表1。

表1 3组基线资料比较〔M(Q1～Q3)〕

1.2主要试剂 人proBDNF双抗体酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(美国R&D Systems，Cat No.DY3175)，mBDNF ELISA试剂盒(澳大利亚南澳大学周新富教授赠送)。

1.3一般变量评估 使用结构性问卷，收集患者一般信息，包括性别、年龄、教育程度。

1.4血浆proBDNF和mBDNF浓度 清晨空腹肘静脉采血，5 000 r/min离心5 min，分离血浆，冻于-80℃备用。采用ELISA测定血浆中proBDNF和mBDNF浓度。proBDNF 测定根据说明书进行。mBDNF ELISA测定简述如下〔15,20〕：G 蛋白纯化的小鼠抗-mBDNF 单克隆抗体(工作浓度1 μg/ml)包被酶标板,37℃ 1 h。磷酸盐缓冲液(PBS)洗板,3%牛血清白蛋白(BSA)室温封闭1 h。加样:标准品为重组mBDNF 蛋白,倍比稀释加入,范围0～2 000 pg/ml,每孔加入血浆100 ml或淋巴细胞提取蛋白，37℃,1 h,磷酸盐Tween-20缓冲液(PBST)洗板,加入检测抗体——生物素标记的羊抗mBDNF 抗体(工作浓度0.15 μg/ml),37℃,1 h。PBST 洗板,加入辣根过氧化物酶标记链霉素亲和素(Streptavidin-HRP)37℃,1 h,PBST洗板,加入新鲜配制的3，3′,5,5′-四甲基联苯胺(TMB)底物,室温避光,10～15 min 内显色。加入0.1 mol/L HCL 终止反应,用Model 2550 EIA reader 于450 nm 读取OD 值。

1.5血浆葡萄糖、胰岛素水平测定 清晨空腹采集静脉血，测定糖化血红蛋白、空腹血糖和空腹胰岛素。之后，口服葡萄糖粉75 g(溶解于300 ml水中)后，测定60 min、120 min时的静脉血浆葡萄糖和胰岛素水平。胰岛素抵抗评价采用稳态模型胰岛素抵抗指数(HOMA-IR=胰岛素浓度×空腹血糖/22.5)。

1.6血浆炎症因子测定 清晨空腹采集静脉血，测定血常规(白细胞、淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞和血小板计数)，C反应蛋白(CRP)和白细胞介素(IL)-6。

1.7认知功能评定

1.7.1韦氏记忆量表测定 ①图片回忆、视觉再认、视觉再生、联想学习、触觉记忆及逻辑记忆反映短时记忆力。②顺背数字、倒背数字及顺背+倒背数字反映瞬时记忆力。③图片回忆、联想学习及逻辑记忆反映注意力。④联想学习和逻辑记忆反映理解记忆力。⑤视觉再生和触觉记忆反映视空间能力。⑥倒背数字、视觉再生及触觉记忆反映执行功能。⑦逻辑记忆还可以反映情景记忆和语言理解。

1.7.2连线试验A、B测验 主要测定执行能力、注意力和注意转换能力，连线试验A、B及(B-A)耗时越长，此项能力越差〔21〕。

1.8统计学分析 采用SPSS23.0软件进行Kruskal-WallisH检验、Mann-WhitneyU检验、Spearman相关分析。

2 结 果

2.1血浆中proBDNF和mBDNF浓度 与对照组相比，T2DM组和T2DM伴认知障碍组血浆proBDNF增加，T2DM伴认知障碍组最显著(P<0.01)。相反，T2DM组和T2DM伴认知障碍组血浆mBDNF显著下降，T2DM伴认知障碍组最显著(P=0.00)。见表2。

2.23组葡萄糖代谢指标比较 与对照组相比，T2DM组和T2DM伴认知障碍组空腹血糖、糖化血红蛋白、餐后2 h血糖、空腹胰岛素和HOMA-IR水平组明显升高(P<0.05)，T2DM伴认知障碍组升高最显著。见表2。

2.3炎症指标的差异 与对照相比，T2DM组和T2DM伴认知障碍组的单核细胞计数、IL-6、CRP水平均明显升高(均P<0.05)，提示T2DM时，炎症反应增加。见表2。

表2 各组葡萄糖代谢结果指标〔M(Q1～Q3)〕

2.4血浆proBDNF、mBDNF水平和糖代谢指标的相关性 血浆proBDNF水平与餐后2 h血糖呈正相关(P<0.05)，血浆mBDNF与餐后2 h血糖、糖化血红蛋白呈负相关(P<0.05)。见表3。

表3 血浆和淋巴细胞中proBDNF、mBDNF水平与糖代谢指标的相关性

2.5proBDNF和mBDNF与炎性因子的相关性 proBDNF水平与单核细胞计数、淋巴细胞计数及IL-6呈正相关(均P<0.05)。mBDNF与单核细胞计数呈负相关(P<0.05)，见表4。

表4 血浆proBDNF和mBDNF水平与炎症的相关性

2.6认知功能评价

2.6.1总体认知评价 对照组MoCA评分为28(27～30)分，T2DM组MoCA评分为28(27～29)分，与对照组比较，T2DM伴认知障碍组MoCA总分〔23(21～23)分〕显著下降(Z=91.9，P<0.001)。

2.6.2韦氏记忆量表评价 与对照组相比，T2DM伴有认知障碍组图片回忆、视觉再认、视觉再生、联想学习、理解记忆、顺背数字、倒背数字和顺背+倒背数字测试得分均显著下降(P<0.05)。T2DM组图片回忆、视觉再认、理解记忆和顺背+倒背总分明显低于对照组(均P<0.05)。见表5。

表5 3组韦氏记忆测定分量表评分比较〔M(Q1～Q3)，分〕

2.6.3连线试验 与对照组相比，T2DM组、T2DM评认知障碍组连线A、B耗时和连线(B-A)耗时差更长(P<0.05)，T2DM伴有认知障碍组耗时最长(均P<0.05)。见表6。

表6 3组连线试验结果比较〔M(Q1～Q3)，s〕

2.7血浆proBDNF和mBDNF水平与认知功能的相关性 血浆proBDNF和MocA总分、图片回忆、视觉再认、理解记忆、顺指数字、倒背数字、顺背+倒背数字呈负相关，与连线试验呈正相关，mBDNF和MocA总分、图片回忆、视觉再认、视觉再生、联想学习、理解记忆、顺倒背数字呈正相关，与连线A耗时、连线B耗时、连线(B-A)耗时呈负相关(P<0.05，P<0.01)。见表7。

3 讨 论

BDNF在内质网中先合成proBDNF，在细胞内由furin蛋白酶酶切成mBDNF。proBDNF和mBDNF存储在突触前膜致密囊泡中，通过特定方式分泌到细胞外。分泌到细胞外的proBDNF由组织纤维蛋白溶解酶(tPA)或基质金属蛋白酶(MMPs)酶切形成mBDNF〔12〕。ProBDNF和mBDNF分别与p75神经营养素受体(p75NTR)和酪氨酸激酶受体B (TrkB)结合，对神经元存活、突触可塑性，学习和记忆起着相反的生物学作用〔7,12，13〕。

有研究表明，肥胖、T2DM、神经退行性疾病患者血清中BDNF水平较低〔22〕。既往的研究表明，T2DM患者长期存在的胰岛素抵抗和慢性高胰岛素血症，引起大脑胰岛素信号失调和葡萄糖代谢障碍，会促进Aβ和NFTs形成、皮层和海马神经元丢失、乙酰胆碱下降，损害学习和记忆〔23〕。本研究与之前的研究结果〔11〕一致，T2DM合并认知障碍组的空腹和餐后血糖水平最高，空腹胰岛素水平最高，HOMA-IR显示胰岛素抵抗水平最高。先前的研究表明，BDNF在胰岛素抵抗和能量平衡中起作用〔11〕。本研究结果提示proBNDF和mBDNF失平衡与T2DM持续的高血糖水平和餐后2 h血糖有关，进而对T2DM患者的认知功能产生影响。

全身炎症反应与胰岛素抵抗、T2DM动脉粥样硬化之间存在关联〔11〕，炎症反应也被认为与各种痴呆类型有关；与之前的研究〔11〕结论一致。之前的研究也发现，慢性炎症状态、免疫系统增强和循环中炎症细胞因子改变与BDNF表达有关〔11〕。既往研究显示，在活化的抗原特异性T细胞和B细胞中，单核细胞产生BDNF和IL-6〔24〕。既往的研究表明，在多种炎症性疾病中，proBDNF 信号在单核细胞、巨噬细胞或小胶质细胞中激活，对炎症反应有强烈的诱导作用，如脊髓损伤小鼠模型中，proBDNF可以通过调节 ED1+巨噬细胞的浸润和迁移加重脊髓损伤。弓形体脑炎中，单核/巨噬细胞中的 proBDNF信号参与了外周免疫细胞进入大脑的过程。本研究结果提示，T2DM患者存在的炎症反应与proBDNF和mBDNF失平衡相关，可能与T2DM的糖代谢障碍和认知损伤相关。

BDNF被认为与神经变性疾病密切相关。先前的研究发现了BDNF可以透过血脑屏障〔25〕。血清和皮层BDNF水平呈高度正相关〔26〕。研究发现，AD患者的血浆BDNF水平降低〔27〕，与大脑海马BDNF表达降低相一致。既往的研究显示，T2DM患者血清BDNF 浓度与延迟记忆损伤相关〔16〕。有一些研究证实了包括抑郁〔14〕、AD、脑外伤、酒精依赖等神经精神疾病，与外周 proBDNF水平改变密切相关〔20,28～30〕。前期研究发现了重症抑郁患者外周血proBDNF与抑郁评分正相关〔14〕。

已有研究证实，proBDNF/mBDNF平衡对神经元可塑性和神经元连续更新有重要作用〔12〕。与多种神经退行性疾病，包括衰老、AD〔31〕和艾滋病相关痴呆〔32〕相关。mBDNF通过与TrkB结合，促进神经元的存活、增加突触可塑性，促进记忆〔13〕。proBDNF是一个强大的神经退行性疾病促进因子，通过激活p75NTR和sortilin受体复合物，显著抑制神经干细胞增殖、减少神经元分化、引起神经突起塌陷、神经元凋亡和抑制神经发生〔33〕，从而损害认知功能〔7,12〕。最近的研究还发现，血清proBDNF与脑内磷酸化的Tau蛋白呈正相关〔34〕。目前的研究结果表明proBDNF/mBDNF失平衡可能促进了T2DM认知障碍的进展。

T2DM认知障碍的机制是复杂的，存在着胰岛素抵抗、脑小血管损伤、血脑屏障渗漏、炎症和氧化应激等共同的病理生理机制〔35〕。结果，T2DM时，proBDNF和mBDNF失平衡可能是T2DM患者胰岛素抵抗和认知障碍的共同分子机制。本研究结果提示，升高的血糖水平、全身炎症状态、改变的循环炎症细胞因子与BDNF失平衡相关，这需要在未来的研究中得到证实。由于外周血易获得，本研究结果也将提示，proBNDF/mBDNF可否成为 T2DM 认知障碍发展的重要的生物学标记，为疾病监测提供依据。

既往对抑郁研究表明，调节proBDNF和mBDNF平衡，与症状改善相关。运动和电休克可以提高海马区furin、tPA和MMP-9的水平，增加proBDNF转化为mBDNF，可以减轻小鼠的抑郁样行为〔36，37〕。既往的研究得出，运动〔38〕和限制饮食〔39〕可以提高BDNF水平，增加神经元对损伤的耐受性，同时改善肥胖、T2DM和认知功能，提高空间学习和记忆。本研究进一步提出，调整血糖水平，特别是餐后血糖水平，可能改善proBDNF和mBDNF的失平衡，从而改善T2DM的认知损伤。

根据目前的研究结果，推测proBDNF与mBDNF失平衡，可能通过不同通路，在神经元网络调节效应和能量消耗的稳态平衡中发挥不同作用，但具体作用机制有待继续研究。研究结果也提示，探索调节T2DM时proBDNF和mBDNF的生物合成过程，如改变饮食和运动，增加mBDNF正性作用或降低proBDNF负性作用，可能为开发新的治疗方法提供机会。