小儿呼吸道合胞病毒肺炎风热郁肺证脂类及氨基酸类代谢组学研究

徐超， 迟磊， 崔振泽

呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus，RSV)是婴幼儿时期呼吸道感染的重要病原之一[1]，轻者仅有上呼吸道症状，重者表现为毛细支气管炎及肺炎，甚至可因呼吸衰竭而死亡[2]。而更值得业界关注的是，RSV感染后易发生反复喘息，与小儿支气管哮喘的形成和反复发作的关系最为密切，在哮喘的发生发展和加重中被认为是一个重要的危险因子[3-4]。

RSV感染属于传统医学中小儿外感热病的范畴，古代医家称之为“风温”“肺热病”“肺炎喘嗽”。针对RSV感染的反应不同，中医开展辨证施治，研究资料显示，风热郁肺证常作为小儿RSV肺炎起初的重要证候。如何利用现代医学手段科学全面地阐述这一中医证候的本质与内涵，成为亟需解决的迫切问题。中医学认为证候是对机体在疾病发展过程中某一阶段病因、病理、病机、病位的概括，具有多因素、多层次、整体性的特点[5]。而代谢组学是运用现代分析技术获得内源性代谢产物谱以认识机体的整体功能状态，具有时相性、动态性、整体性、系统性等特点，与中医证候特点相吻合[6]。基于上述中医证候与代谢组学的相通之处，应用现代微观的代谢组学技术研究中医宏观证候本质已成为目前中医研究的重要手段之一。本研究拟采用液相色谱-质谱联用(liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS)技术从整体角度探讨小儿RSV肺炎风热郁肺证患儿血清的内源性差异代谢特征，阐释小儿RSV肺炎风热郁肺证的差异代谢证候实质。

1 对象与方法

1.1 研究对象 收集2017年11月至2018年4月大连市儿童医院住院的毛细支气管炎和(或)肺炎患儿30例，其中男17例，女13例，男女比例1.3∶1，月龄4～24个月，平均(11.37±5.82)个月。同期选取我院健康体检儿童30例为对照组，其中男18例，女12例，男女比例1.5∶1，月龄2～24个月，平均(10.34±4.78)个月。两组性别、年龄比较，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

1.2 诊断标准

1.2.1 西医诊断标准 参照《儿童社区获得性肺炎管理指南(2013修订)》中毛细支气管炎和(或)肺炎的诊断标准[7]。

1.2.2 中医诊断标准 参照世界中医药学会联合会儿科分会制定的《小儿病毒性肺炎中医诊疗指南》[8]。“肺炎喘嗽”风热郁肺证辨证分型：发热恶风、咳嗽、气喘、痰黄或闻喉间痰鸣、有汗、鼻流清涕或黄涕、咽红肿、口渴欲饮、纳呆、面色红、舌质红、苔薄黄，指纹浮紫。

1.3 纳入标准 (1)符合毛细支气管炎和(或)肺炎的中西医诊断标准；(2)年龄2个月至2岁；(3)病程在72 h以内；(4)经检测鼻咽部分泌物RSV抗原和(或)检测血清RSV-IgM阳性者；(5)患儿家属签署知情同意书。

1.4 排除标准 重症肺炎及其他呼吸系统疾病。

1.5 检测方法

1.5.1 试剂与仪器 乙腈(Merck,Germany)；甲酸(Sigma-Aldrich,USA)；超纯水由MilliQ系统制备(Millipore，USA)；ACQUITY UPLC BEH C8色谱柱、Waters ACQUITY超高效液相色谱系统(Waters，USA)；AB triple TOFTM 5600质谱(Applied Biosystems，USA)。

1.5.2 样品采集及处理 留取门诊体检健康儿童及入院24 h内患儿空腹血清，约2 mL，保存于-80 ℃冰箱内，避免反复冻融。测定前，室温解冻血清，8 000 r/min离心10 min，取上清液100 μL，加入400 μL纯水，涡旋1 min，8 000 r/min再次离心10 min，取上清液即可。

1.5.3 LC-MS代谢组学分析 (1)液相条件：色谱分离系统采用Waters ACQUITY超高效液相色谱。采用ACQUITY UPLC BEH C8(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)色谱柱，柱温60 ℃，进样量5 μL。流动相A相和B相分别为0.1%甲酸水溶液和0.1%甲酸乙腈。洗脱梯度：5%B保持0.5 min，2 min时线性升至60%B，8 min时线性升至100%B，保持2 min，0.1 min内回到初始比例5%B以平衡色谱柱，总分析时长12 min。流动相流速为0.4 mL/min。

(2)质谱条件：使用AB triple TOFTM 5600质谱(Applied Biosystems,USA)作为检测系统。雾化气流流速55 psi，辅助加热气流流速55 psi；气帘气流速35 psi；质谱扫描范围为m/z80～1 000，碰撞电压10 V；信息依赖型采集(IDA)模式扫描范围为m/z60～1 000，碰撞电压40 V。正离子喷雾电压范围5.5 kV，离子源温度550 ℃；负离子喷雾电压范围4.5 kV，离子源温度450 ℃。

1.6 统计学方法 采用Marker View 1.2.1.1软件(Applied Biosystems,USA)提取离子原始峰表。导出的峰表经过滤，用总峰面积进行标准化归一处理，通过已知代谢物数据库对代谢物进行定性。采用SIMCA-P 11.0软件(Umetrics)进行多元统计分析，建立主成分分析(principle component analysis，PCA)及正交偏最小二乘法判别分析(orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA)数学模型，并对相应主成分的变量重要性(variable importance in the project，VIP)进行计算，选取VIP值>2的变量，采用SPSS 17.0软件对其进行非参数检验，同时满足VIP值>2且P<0.05的物质为最终的差异性代谢物。

2 结果

2.1 RSV肺炎风热郁肺证患儿样本代谢轮廓分析及模式识别 采用SIMCA-P软件首先对样本数据建立非监督的PCA分析，得分图如图1，图中横坐标和纵坐标分别代表主成分中的第一个和第二个主成分，得分图反应了各个样本在两个主成分组成的坐标体系中的分布情况，模型参数R2X=0.722，Q2=0.36，模型分析了72.2%的原始数据，由图1可见，两组之间存在一定的交叉重叠，分离不明显。

图1 正常儿童与RSV肺炎风热郁肺证患儿的PCA得分图(黑色代表RSV肺炎风热郁肺证患儿，灰色代表正常儿童)

进一步建立OPLS-DA模型，如图2所示，两组样本分别集中分布在中线的两侧，分离趋势明显，说明两组在代谢产物方面具有一定的差异。响应置换检验(permutation test)参数：R2Y=0.86，Q2=0.649，以上数据说明数学模型可靠稳定。

2.2 RSV肺炎风热郁肺证患儿差异代谢产物分析结果 基于有效OPLS-DA模型下筛选出有差异代谢产物，获得S-Plot示意图(图3)，图3显示了代谢产物的分布情况，偏离中心越远的产物，表明该变量对模型的贡献越大，成为差异性代谢产物的可能性也就越大。其次，计算OPLS-DA模型中的变量VIP值(图4)提取VIP值>2的变量，并进行t检验(表1)，共筛选出5个RSV肺炎风热郁肺证的差异代谢物(P<0.05)，两组的差异代谢物相对含量见图5。分别为：苯丙氨酸(phenylalanine，Phe);色氨酸(tryptophan，Try);磷脂酰胆碱(34∶3)(phosphatidylcholine 34∶3，PC 34∶3)；2个鞘磷脂(sphingomyelin,SM)，包括SM36∶1，SM34∶0。

图2 正常儿童与RSV肺炎风热郁肺证患儿的OPLS-DA得分图(黑色代表RSV肺炎风热郁肺证患儿，灰色代表正常儿童)

图3 基于OPLS-DA分析的S-PLOT图

图4 基于OPLS-DA分析的VIP图

图5 两组儿童差异代谢产物的相对含量(黑色代表RSV肺炎风热郁肺证患儿，灰色代表正常儿童)

表1 两组儿童差异代谢产物的VIP值、t值及变化趋势

3 讨论

谢玉琼的《麻科活人全书》对“肺炎喘嗽”进行首次描述：“气促之证，多缘肺热不清所致……如肺炎喘嗽。”其中“肺”指病位，“炎”指病性即肺脏热盛，“喘”和“嗽”则指临床症状和体征。《素问·通评虚实论》曰：“乳子中风热，喘鸣肩息者……”，一方面描述出婴儿喘鸣症状与病毒性感染所引起的吸气性三凹征等喘憋性肺炎极为相似；另一方面引出病因即风热，推测小儿肺炎喘嗽多为热证。“病温者，始于上焦”的描述，揭示出在婴幼儿时期的肺脏是较易患相关感染性疾病的。肺为华盖，又属娇脏，易最先受邪，加之小儿“肺常不足”，素体“阳常有余”，故肺部受邪后导致肺气不宣，淸肃不行，出现发热、咳嗽、喘促等症状，且外感易于热或外感寒邪速入里化热，则易发为风热郁肺证。

笔者基于LC-MS技术的代谢组学平台分析范围广、灵敏性高，可全面地表征RSV肺炎风热郁肺证患儿血清代谢组的特异性变化，为进一步探讨小儿RSV肺炎风热郁肺证的发病机制及与哮喘的相关性提供参考依据。本研究采用LC-MS技术检测风热郁肺证肺炎与正常儿童的血清代谢物后发现，风热郁肺证肺炎与正常儿童的代谢谱存在显著差异，部分差异代谢物结构已经确认，主要有脂类物质(PC 34∶3、SM36∶1、SM34∶0)和氨基酸类(Phe-Phe、Tryptophan)，其中磷脂酰胆碱(phosphatidylcholine，PC 34∶3)和苯丙氨酸(Phe-Phe)明显低于正常儿童，鞘磷脂(SM36∶1、SM34∶0)和色氨酸(Tryptophan)明显高于正常儿童，均有统计学意义。

从上述结果可见，风热郁肺证RSV肺炎患儿血清异常代谢物的脂类物质主要是甘油磷脂代谢途径的磷脂酰胆碱和鞘脂代谢途径的鞘磷脂，与文献报道一致，即脂肪酸的代谢直接或间接与热证相关联[9]。磷脂酰胆碱是肺泡表面活性物质(pulmonary surfactant，PS)的最主要成分，而PS又具有先天免疫功能，有助于肺部感染的预防和炎症控制[10]，而RSV感染所引起的炎症和免疫反应亦与PS的变化有关[11]，表面活性磷脂促进病毒进入宿主细胞，同时又具有抗病毒感染作用，可通过阻碍病毒配体与细胞表面受体结合以破坏细胞膜间的作用[12]。由此可以表明RSV肺炎易感原因之一，即机体的甘油磷脂代谢紊乱，磷脂酰胆碱含量降低，进而导致机体免疫功能减弱，抗病毒能力降低，从而易感。本实验结果显示RSV肺炎风热郁肺证患儿血清中鞘磷脂(SM36∶1、SM34∶0)含量呈上升趋势，这一现象表明RSV肺炎风热郁肺证患儿鞘脂代谢也受到了扰乱。首先，鞘磷脂类及其代谢产物参与了多种信号传导通路，在诸多病理过程中发挥重要作用，部分化合物的异常会导致一系列的效应，引起过敏和炎症[13]。其次，富含鞘磷脂的特殊膜结构脂筏是多种病毒复制过程中的重要因素，如病毒入胞、胞内定向转运、转运病毒蛋白等[14]，RSV感染时脂筏主要与病毒颗粒的释放有关[15]。由此揭示了RSV肺炎机体鞘磷脂代谢与RSV复制及病毒颗粒释放有关，可能呈现正相关的趋势。

本实验结果显示，RSV肺炎风热郁肺证患儿机体不仅存在脂类代谢异常，氨基酸代谢也出现了异常的紊乱，即苯丙氨酸含量降低、色氨酸含量升高。氨基酸在许多物质代谢通路中起重要作用，它们不仅是重要的酶底物，也是重要的调节物，蕴含着重要的反映机体代谢和功能状态的生物化学信息[16]。任何一种氨基酸的缺失都会影响免疫系统和其他器官功能的正常发挥[17]。研究表明，苯丙氨酸在体内氧化生成酪氨酸，酪氨酸经转氨基作用最终代谢成延胡索酸和乙酰乙酸，两者均是含有苯环。且苯丙氨酸是一种必需氨基酸，这些含苯基的化合物主要经由肠道内的菌群代谢产生，即苯丙氨酸的代谢与肠道菌群代谢具有一定的相关性[18]。前期基础实验也表明，RSV感染会影响大鼠机体内的菌群代谢[19]。综上笔者推测，RSV感染是由于干扰了肠道的正常菌群代谢，使苯丙氨酸生成减少。色氨酸也是人体的必需氨基酸之一，在代谢网络调控中起重要作用，研究表明，色氨酸代谢主要发生于炎症组织中[20]，被吲哚胺2,3-双加氧酶诱导的色氨酸降解是有效的抗病毒途径[21]。本研究结果显示，RSV肺炎风热郁肺证患儿血清中色氨酸含量升高，提示病程初期RSV病毒的复制增多与色氨酸含量高，没被降解有关。另一方面色氨酸代谢还具有免疫调节作用，是T细胞活化增殖过程中合成蛋白质所必需的氨基酸，即氨基酸的增多可促进T细胞的活化，诱导免疫级联反应，从而加重炎症反应[22]，进一步揭示了RSV肺炎病情严重可能与色氨酸升高有关。

综上所述，本实验基于GC-MS技术对RSV肺炎风热郁肺证患儿的血清进行研究，利用OPLS-DA的方法探讨血清内源性代谢物的模式变化规律，发现了与RSV肺炎风热郁肺证密切相关的多种代谢物。但也存在一定的局限性，本研究仅观察了发现集，发现RSV肺炎风热郁肺证患儿的血清中磷脂酰胆碱、鞘磷脂、苯丙氨酸、色氨酸发生了明显的变化。下一步研究考虑对验证集的观察，以验证RSV肺炎风热郁肺证的代谢标志物，为中医证候的客观性提供了实验依据。