解郁化痰法对慢性不可预知温和刺激法诱导抑郁模型大鼠的治疗作用及对海马区炎性反应、氧化应激损伤的影响※

李瑞芳 牛燕运 刘建平

(1.河北省邯郸市中医院药剂科，河北 邯郸 056001；2. 河北省邯郸市中医院心血管科，河北 邯郸 056001)

冠心病是指因冠状动脉血管发生动脉粥样硬化导致血管腔狭窄而诱发的心脏病，经皮冠状动脉介入治疗术(PCI)是临床上治疗冠心病的主要方法之一，但由于受患者对PCI的不了解及对术后病情恢复情况的担忧等因素影响，导致部分患者PCI术后常出现焦虑抑郁的情绪，甚至发展为PCI术后抑郁症，已经成为临床上亟待解决的问题[1]。目前，西医临床对于PCI术后抑郁仍以对症治疗为主，其中氟西汀是临床上的常用抗抑郁药，但其药物不良反应多，临床应用受到一定限制[2]。近年来，中医药以多靶点、多效应、副作用小的特点，在抗抑郁治疗方面取得了显著效果[3-4]。中医学认为，抑郁的发生与气郁、痰凝有关，解郁化痰法在治疗中风后抑郁症[5]、失眠抑郁[6]等方面均有很好的临床疗效。为进一步深入探讨解郁化痰法治疗抑郁的作用机制，我们拟通过慢性不可预知温和刺激法(CUMS)建立大鼠抑郁模型，观察解郁化痰丸对抑郁模型大鼠海马区炎性反应及氧化应激损伤影响，以期为临床上PCI术后抑郁症的治疗提供数据参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物 无特定病原体(SPF)级雌性SD大鼠40只，体质量(200±20)g，饲养于屏障环境，温度(25±2)℃，湿度(55±10)%，光照周期(12 h/12 h)，购于浙江省实验动物中心，实验动物使用许可证编号:SYXK(浙) 2021-0040。

1.2 实验药物 解郁化痰丸(药物组成：夏枯草、白芍各9 g，白芷、羌活、秦艽、茯苓、半夏、葛根、煅牡蛎、菊花各6 g，天麻4.5 g。将上述中药材按量称取，在研钵中研磨成粉末状，并用醋调匀成糊状，制备成丸剂，所有药物均购于同仁堂药房)；氟西汀盐酸盐及二甲基亚砜(美国Sigma公司)。

1.3 主要实验试剂与仪器

1.3.1 试剂 实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)试剂盒、反转录试剂盒、总RNA抽提的试剂Trizol(日本Takara公司)；白细胞介素1β(IL-1β)、IL-6、IL-8及肿瘤坏死因子α(TNF-α)大鼠酶联免疫吸附(ELISA)法检测试剂盒(美国赛默飞世尔公司)；活性氧(ROS)、丙二醛(MAD)、超氧化物歧化酶(SOD)及谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)检测试剂盒(南京建成生物工程研究所)。

1.3.2 仪器 FA2004电子天平(北京六一仪器仪表有限公司)；H2050R冷冻离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司)；高温干燥箱(上海森信实验仪器有限公司)；水浴锅(上海赫田科学仪器有限公司)；低速离心机及ABI Step One Plus实时荧光定量PCR仪(美国赛默飞世尔公司)；iMarker全自动酶标仪(美国Bio-Rad公司)；移液器(德国Eppendorf公司)；ENV-250型旷场测试装置(武汉一鸿科技有限公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 动物分组及造模[7]将40只SD大鼠随机分为空白对照组、模型组、氟西汀治疗组、解郁化痰丸治疗组。除空白对照组外，其余3组均采用CUMS建立抑郁症模型：依次采用夹尾(使用夹尾钳夹尾大鼠尾尖1 min)、禁食禁水(禁止饮食和饮水24 h)、潮湿垫料(垫料用水泡湿24 h)、笼具倾斜(在鼠笼下放木块，使鼠笼倾斜24 h)、异物(在鼠笼中放石砖24 h)及异味(在鼠笼中喷洒30%冰醋酸，保持24 h)方式对大鼠进行刺激，每日进行1项，轮流进行，共连续刺激6周，大鼠出现明显的活动量下降、摄食量下降、睡眠时间减少、呆滞等行为改变表示造模成功。

1.4.2 给药 造模结束后，给药剂量按照人与大鼠的比表面积进行剂量比换算，氟西汀治疗组大鼠予氟西汀药液20 mg/kg灌胃，解郁化痰丸治疗组予解郁化痰丸药液16 mg/kg灌胃，空白对照组和模型组分别予等容积0.9%氯化钠注射液4 mL/kg灌胃，每日1次，连续灌胃21 d。

1.5 观察指标及方法

1.5.1 体质量 各组大鼠在灌胃期间每7 d测量1次体质量，评估大鼠体质量变化情况。计算3次平均值。

1.5.2 糖水偏爱实验[8]各组大鼠在灌胃期间每7 d进行1次糖水偏爱实验，评估大鼠兴趣变化情况。每只大鼠给予1瓶1%的蔗糖水和1瓶饮用水，记录大鼠在1 h内蔗糖水和饮用水的饮用量，然后依据计算公式计算大鼠对糖水的偏爱程度。大鼠糖水偏爱百分比(%)=蔗糖水消耗体积/(蔗糖水消耗体积+饮用水消耗体积)×100%。计算3次平均值。

1.5.3 旷场实验[9]各组大鼠在灌胃期间每7 d进行1次旷场实验，评估大鼠活动量变化情况。使用100 cm×100 cm×40 cm的旷场测试装置，用白线将地面分成25个方格，每格20 cm×20 cm，四周涂黑，在安静条件下将大鼠放置于实验箱中央格内，并观察5 min内大鼠在中央格的停留时间。计算3次平均值。

1.5.4 强迫游泳实验[10]各组大鼠在灌胃期间每7 d进行1次强迫游泳实验，评估大鼠行为绝望状态。将大鼠放入水浴锅中进行强迫游泳6 min，记录大鼠在后4 min内静止不动的总时间，即为行为绝望状态时间。计算3次平均值。

1.5.5 海马区炎症因子及氧化应激指标 灌胃结束后各组取5只大鼠，采用颈椎脱臼法处死，分离大鼠大脑海马区组织，使用匀浆仪匀浆，随后在4 ℃、12 000 r/min条件下离心，吸取上清液，检测大鼠海马区炎症因子IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α水平及氧化应激指标ROS、MAD、SOD及GSH-Px水平，相关操作均严格按照试剂盒说明书进行。

1.5.6 海马区损伤情况 通过检测海马区神经元蛋白激酶C(PKC)及肌醇三磷酸(IP3)基因表达情况评估海马区损伤情况。灌胃结束后各组取5只大鼠，采用颈椎脱臼法处死，分离大鼠大脑海马区组织，各组取100 mg海马区组织于液氮中，在研钵中充分粉碎，加入Trizol 1 mL，4 ℃裂解15 min，按照说明书操作提取组织总RNA。用1000 ng的总RNA于PCR仪中进行反转录得到互补DNA(cDNA)，反转录体系见表1，设置PCR仪参数25 ℃，5 min，42 ℃，1 h，70 ℃，5 min。结束后将cDNA样品取出，放入多功能酶标仪中检测cDNA浓度。然后使用ABI Step One Plus实时荧光定量PCR仪进行扩增反应，以β-actin作内参照，采用2-△△CT法分析样品的相对表达量。PCR引物由美国Invitrogen公司合成，引物序列见表2。

表1 反转录体系

表2 引物序列

2 结果

2.1 各组大鼠体质量、糖水偏爱百分比、中央格停留时间及行为绝望状态时间比较 与空白对照组比较，模型组大鼠体质量降低(P<0.05)，糖水偏爱百分比减小(P<0.05)，中央格停留时间和行为绝望状态时间均增加(P<0.05)。与模型组比较，氟西汀治疗组和解郁化痰丸治疗组大鼠体质量均增加(P<0.05)，糖水偏爱百分比均增大(P<0.05)，中央格停留时间和行为绝望状态时间均减少(P<0.05)，且解郁化痰丸治疗组大鼠体质量高于氟西汀治疗组(P<0.05)，糖水偏爱百分比大于氟西汀治疗组(P<0.05)，中央格停留时间和行为绝望状态时间均少于氟西汀治疗组(P<0.05)。见表3。

表3 各组大鼠体质量、糖水偏爱百分比、中央格停留时间及行为绝望状态时间比较

2.2 各组大鼠海马区炎症因子IL-1β、IL-6、IL-8及TNF-α水平比较 与空白对照组比较，模型组大鼠海马区IL-1β、IL-6、IL-8及TNF-α水平均升高(P<0.05)。与模型组比较，氟西汀治疗组和解郁化痰丸治疗组大鼠海马区IL-1β、IL-6、IL-8及TNF-α水平均降低(P<0.05)，且解郁化痰丸治疗组大鼠IL-1β、IL-6、IL-8及TNF-α水平均低于氟西汀治疗组(P<0.05)。见表4。

表4 各组大鼠海马区炎症因子IL-1β、IL-6、IL-8及TNF-α水平比较

2.3 各组大鼠海马区氧化应激指标ROS、MAD、SOD及GSH-Px水平比较 与空白对照组比较，模型组大鼠海马区ROS及MAD水平均升高(P<0.05)，SOD及GSH-Px水平均降低(P<0.05)。与模型组比较，氟西汀治疗组和解郁化痰丸治疗组大鼠海马区ROS及MAD水平均降低(P<0.05)，SOD及GSH-Px水平均升高(P<0.05)，且解郁化痰丸治疗组大鼠ROS及MAD水平均低于氟西汀治疗组(P<0.05)，SOD及GSH-Px水平均高于氟西汀治疗组(P<0.05)。见表5。

表5 各组大鼠海马区氧化应激指标ROS、MAD、SOD及GSH-px水平表达情况比较

2.4 各组大鼠海马区PKC及IP3基因相对表达比较 与空白对照组比较，模型组大鼠海马区PKC及IP3基因相对表达水平均升高(P<0.05)。与模型组比较，氟西汀治疗组和解郁化痰丸治疗组大鼠海马区PKC及IP3基因相对表达水平均降低(P<0.05)，且解郁化痰丸治疗组大鼠PKC及IP3基因相对表达水平均低于氟西汀治疗组(P<0.05)。见表6。

表6 各组大鼠海马区PKC及IP3基因相对表达水平情况比较

3 讨论

PCI术后抑郁症发生的原因十分复杂，有研究报道认为PCI术后焦虑抑郁的发生与患者的年龄、学历、不良生活嗜好、基础病情况、既往PCI史、手术时长、支架置入数量及医保报销情况等有关[14]。PCI术后抑郁症的发病机制至今也没有明确的定论，除了单胺假说、受体假说、神经内分泌假说和神经可塑性假说以外，Maes M等[15]还提出了抑郁症的细胞因子假说，其通过论证发现抑郁症的发生往往伴随着中枢神经系统的炎性反应和氧化应激损伤，炎症因子分泌增多和氧化应激指标平衡失调导致大脑组织持续的慢性损伤，从而引起抑郁症相关的行为改变。CUMS建立的大鼠抑郁模型就是通过模拟人类生活中的一些不良事件，通过改变大鼠的生活环境、饮食条件及疼痛刺激等方式，给大鼠大脑产生持续的应激，促炎症细胞因子的释放，降低脑源性神经营养因子(BDNF)水平，从而导致大鼠出现焦虑抑郁的行为[16]。本研究结果显示，与空白对照组比较，模型组大鼠体质量降低(P<0.05)，糖水偏爱百分比减小(P<0.05)，中央格停留时间和行为绝望状态时间均增加(P<0.05)，提示模型组大鼠在饮食、兴趣、活动量及行为绝望状态上均出现了明显的变化。

海马区是机体大脑的一个重要区域，能帮助机体进行学习、记忆等，处理日常生活中的短期记忆。在许多结构影像学和病理解剖学中发现，抑郁症患者会出现以海马区为主的边缘结构神经减退等现象，在抑郁症发病的过程中海马区的功能严重减退，重病者可出现体积明显减小[17]。炎性反应本是机体对外界环境刺激的一种防御反应，但过度的炎性反应往往会导致机体组织产生损伤，IL-1β、IL-6、IL-8及TNF-α都是临床上常见的炎症因子，也是引起大脑海马区产生损伤的重要诱导因子[18]。氧化应激是体内氧化与抗氧化作用失衡的状态，氧化应激损伤与机体的衰老及许多病理过程相关，当机体受到有害刺激时会导致体内高活性的自由基如 ROS、MAD等产生过多，一旦超出SOD、GSH-Px等抗氧化酶系统的清除能力，就会导致组织发生氧化应激损伤[19]。PKC广泛存在于细胞和组织内，正常状态下无表达，当细胞受到刺激后PKC被激活，并可伴随Ca2+释放到细胞膜上，而IP3可以促进细胞内Ca2+的释放，在激活PKC过程中起重要作用，两者可作为神经元损伤的定量生化指标[20]。本研究结果显示，与空白对照组比较，模型组大鼠海马区炎症因子IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α水平及氧化应激指标ROS、MAD水平均升高(P<0.05)，SOD及GSH-Px水平均降低(P<0.05)，PKC及IP3基因相对表达水平均升高(P<0.05)，提示模型组大鼠海马区出现了明显的炎性反应和氧化应激损伤，并导致海马区神经细胞出现明显损伤。

抑郁症属中医学郁证的范畴，认为其发病主要与气机不畅有关[21]。中医学认为，肝主疏泄，调情志，情志不遂，导致肝失条达，疏泄失司，肝郁气滞，又横逆克犯脾胃，脾失升清，胃失和降，气机升降失常，水湿津液失于运化敷布，则聚湿成痰，气郁痰凝，蕴结中焦，导致心神受损，清窍失养，脏腑气血阴阳失调而成郁证。解郁化痰丸出自清·梁希曾的《疬科全书》，具有解郁化痰的功效，方中半夏枯草清肝散结解郁；白芍养血柔肝敛阴；白芷祛风燥湿活血；羌活、秦艽解表散寒祛风；茯苓渗湿利水宁心；半夏燥湿化痰消痞；葛根升阳解肌除烦；煅牡蛎敛阴潜阳化痰；菊花疏风清热平肝；天麻行气活血熄风。上述药物配伍使用，共奏疏肝理气解郁、化痰散结安神的功效。氟西汀属于选择性5-羟色胺(5-HT)再摄取抑制剂，可以阻断突触前膜对5-HT的再摄取，延长和增加5-HT的作用时间，从而产生抗抑郁作用[22]。本研究结果显示，与模型组比较，氟西汀治疗组和解郁化痰丸治疗组大鼠体质量均增加(P<0.05)，糖水偏爱百分比均增大(P<0.05)，中央格停留时间和行为绝望状态时间均减少(P<0.05)，海马区炎症因子IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α水平及氧化应激指标ROS、MAD水平均降低(P<0.05)，SOD及GSH-Px水平均升高(P<0.05)，PKC及IP3基因相对表达水平均降低(P<0.05)，且解郁化痰丸治疗组大鼠体质量、糖水偏爱百分比、中央格停留时间及行为绝望状态时间改善均优于氟西汀治疗组(P<0.05)，海马区IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α、ROS、MAD水平均低于氟西汀治疗组(P<0.05)，SOD及GSH-Px水平均高于氟西汀治疗组(P<0.05)，PKC及IP3基因相对表达水平均低于氟西汀治疗组(P<0.05)。提示氟西汀和解郁化痰丸两者对抑郁模型大鼠均有确切的治疗作用，可明显改善大鼠的饮食、兴趣、活动量及行为绝望状态，抑制海马区炎性反应和氧化应激损伤，减轻海马区神经细胞损伤，其中解郁化痰丸的治疗效果更佳。

综上所述，解郁化痰法可以有效缓解抑郁模型大鼠的抑郁行为，增加体质量，其作用机制可能与抑制大鼠海马区炎性反应，提高抗氧化能力，减轻氧化应激损伤有关，从而起到保护神经细胞，改善抑郁症状的作用，为临床上PCI术后抑郁症的治疗提供了新思路。