肉桂挥发油β-环糊精包合工艺优选及特征鉴别

陈海清，李后如，谢俊俊

1.江西省药品检查员中心，江西 南昌 330001；2.江西银涛药业有限公司，江西 抚州 344100

右归胶囊处方中有多种含挥发油成分的中药材，其中肉桂中的挥发油成分具有明显药理作用。但肉桂挥发油性质不稳定，遇光、热等容易氧化分解，且有较强挥发性［1］，为保证挥发油稳定和相应制剂的疗效，实际生产中多采用β-环糊精（β-CD）包合使其固化，最大限度地保留挥发油成分［2］。本研究通过正交试验优选出最佳包合工艺条件，并对包合物进行特征鉴别，可为中药类挥发油的β-CD包合工艺提供借鉴。

1 材料和仪器

1.1 材料

肉桂（亳州市尚品堂中药饮片有限公司，批号：2104001），β-环糊精（安徽山河药用辅料股份有限公司，批号：A21091206），本研究所用无水乙醇、甲醇等试剂均为分析纯。

1.2 仪器

恒温水浴锅（上海力辰邦西仪器有限公司，型号：HH-4）；电子天平（常熟市双杰测试仪器厂，型号：JJ300）；挥发油测定器（泰兴市铭泰科教仪器设备有限公司）；紫外可见分光光度计（上海维科检验仪器有限公司，型号：UV-3226DC）；磁力搅拌器（江苏金坛实验室技术有限公司，型号：DJL-3352）。

2 方法和结果

2.1 包合物制备方法

根据日常生产经验和预实验结果，本研究采用饱和水溶液搅拌法制备肉桂挥发油包合物。精密称量适量β-CD 置于无水干燥的锥形瓶中，加入两倍量的纯化水，将锥形瓶置于恒温水浴锅中，温度控制在80 ℃，缓慢搅拌至溶解后形成饱和溶液，加入适量肉桂挥发油，保持适当温度、搅拌速度和时间，制备完成后降至室温，倾去上清液，过滤所得沉淀用少量水洗，室温下减压真空干燥即为挥发油包合物［3］。

2.2 包合效果评价指标

郭诚诚等［4］研究结果显示，挥发油包合效果的最关键考察指标为挥发油包合率，包合率越高说明包合效果越好，但单纯依靠挥发油包合率无法全面评价包合效果。包合物收得率是工艺稳定性、工业化生产的重要参考指标［5］，为此本研究选择包合物收得率作为次要考察指标。根据国内外参考文献和实验考察结果，本研究将包合物收得率和挥发油包合率作为考察指标，两者权重系数分别为0.3 和0.7。根据上述两个考察指标水平和权重系数计算包合工艺总评分，总评分越高说明包合效果越好。空白回收率实验操作为：精密量取1 mL 肉桂挥发油置于250 mL 容量瓶中，加入纯化水定容至刻度，按照《中国药典》2020 版四部通则2204 挥发油测定法（甲法）测定挥发油收集量，挥发油收集量占挥发油加入量即得，挥发油密度参考《中国药典》2020 版四部通则0601 相对密度测定法，重复检测三次取平均值［6］。具体计算方法见如下公式。

2.3 单因素考察

2.3.1 挥发油与β-CD 比例 精密量取5 份1 mL 肉桂挥发油分别置于5 个无水干燥的锥形瓶中，分别加入精密称量的3 g、5 g、7 g、9 g、11 g 的β-CD，按照“2.1”项下方法制备包合物，并计算挥发油与不同质量β-CD 的包合工艺总评分。从表1 中可见，当投料比（挥发油与β-CD 比例）为1∶5 时总评分最高，因此选择与1∶5 总评分相近的1∶7 和1∶9三个因素水平进行正交试验。

2.3.2 包合温度 精密量取5 份1 mL 肉桂挥发油分别置于5 个无水干燥的锥形瓶中，分别加入精密称量的7 gβ-CD，按照“2.1”项下方法加入β-CD两倍量的纯化水，采用饱和水溶液搅拌法制备挥发油包合物，并计算不同包合温度下的包合工艺总评分。从表1 中可见，当包合温度为40 ℃时，包合工艺总评分最高，本研究选择与包合温度40 ℃总评分相近的35 ℃、45 ℃两个因素水平进行正交试验。

表1 不同单因素水平对包合效果的影响

2.3.3 包合时间 精密量取5 份1 mL 肉桂挥发油分别置于5 个无水干燥的锥形瓶中，分别加入精密称量的7 gβ-CD，按照“2.1”项下方法加入β-CD两倍量的纯化水，采用饱和水溶液搅拌法制备挥发油包合物，并计算不同包合时间下的包合工艺总评分，从表1 中可见，当包合时间为80 min 时，包合工艺总评分最高，因此本研究选择与80 min 相近的60 min、100 min 三个因素水平进行正交试验。

2.4 正交试验优化工艺

本研究考察的三个单因素分别为A（投料比）、B（包合温度）、C（包合时间），通过计算不同包合工艺的总评分，判断三个不同单因素水平对包合效果的影响，具体见表2。从表3 的L9（34）正交试验结果可见，投料比是影响包合效果的主要因素，影响顺次为A1＞A2＞A3；不同包合时间的影响次序为C2＞C3＞C1；不同包合温度的影响次序为B2＞B1＞B3；根据不同包合工艺最终总评分可知，肉桂挥发油β-CD 包合物的最佳工艺条件为A1B2C2，即投料比1∶5，包合温度40 ℃，包合时间80 min。方差分析可见投料比与包合温度、包合时间比较，投料比对包合效果有显著影响（P＜0.05），具体见表4。

表2 包合工艺正交试验因素水平表

表3 挥发油包合工艺正交试验结果

表4 包合工艺影响因素方差分析表

2.5 验证试验结果

根据正交试验选定的最佳工艺条件，按照“2.1”项下的饱和水溶液搅拌法连续制备3 批次肉桂挥发油β-CD 包合物，并分别检测3 批次包合物的挥发油包合率和包合物收得率，根据检测结果计算包合工艺总评分。验证试验3 批次包合物的挥发油包合率、包合物收得率、总评分均与正交试验各项评价指标的最大值接近，由此说明，正交试验优选的最佳工艺重现性好、稳定可靠，具体验证试验结果见表5。

表5 优选包合工艺验证结果

2.6 包合物特征鉴别

2.6.1 薄层色谱鉴别 分别制备4份样品进行薄层色谱鉴别，4 份样品分别为β-CD 饱和溶液（1 号）、肉桂挥发油（2 号）、肉桂挥发油β-CD 包合物（3 号）、包合物中提取的肉桂挥发油（4 号），薄层色谱板为硅胶G 薄层色谱板，显色剂为0.1%二硝基苯肼乙醇溶液，展开剂为石油醚∶乙酸乙酯（19∶2），4 份样品在同一薄层板上点样。薄层色谱结果显示，2 号样品和4 号样品在相同位置出现黄色斑点，两份样品的Rf 值基本一致，此结果说明包合过程没有改变肉桂挥发油的化学性质；1 号样品和3 号样品在相同位置没有出现黄色斑点，此结果说明肉桂挥发油已经被完全包合，包合物表面没有残留，同时证实肉桂挥发油与β-CD 并非简单的物理混合，而是完全形成了包合物。

2.6.2 紫外特征鉴别 分别制备四份样品进行紫外扫描特征鉴别，四份样品分别为β-CD 乙醇溶液（1号）、肉桂挥发油乙醇溶液（2 号）、肉桂挥发油与β-CD 物理混合的乙醇溶液（3 号）、肉桂挥发油β-CD 包合物乙醇溶液（4 号），四份样品均采用无水乙醇制备，四份样品紫外扫描结果显示，4 号样品的最大吸收波长为307.8 nm，3 号样品的最大吸收波长为303.7 nm，2 号样品的最大吸收波长为300.4 nm，挥发油从物理混合至形成包合物的最大吸收波长红移超过7 nm。

3 讨论

肉桂中含有的挥发油是其发挥助阳祛寒、通脉温肾功效的物质基础，肉桂挥发油非常不稳定，长时间存放会出现质地黏稠和颜色加深，这主要源于挥发油的分解和氧化，为避免肉桂挥发油的挥发和氧化［7］，β-CD 包合技术是最有效、成本相对最低的方法。β-CD 的空间结构为环状空腔低聚物，空腔是由7 个葡萄糖分子连接而成，葡萄糖分子之间以α-1，4-糖苷键相互连接，形成内部疏水、外部亲水的中空环状结构，内部疏水性质有利于包合挥发油类物质［8］，且β-CD 内部中空结构孔径在0.8 nm 左右，被包合客分子能形成超微粒分散物，相应制剂的生物利用度和溶出速率也会提高［9］。β-CD 和被包合客分子之间借助范德华力形成稳定的包合物，两者之间不会发生化学反应，整个包合过程完全属于物理过程，被包合客分子的原有性质和药理作用不会发生改变［10］，加上β-CD 本身无任何药理活性作用和不良反应，因此β-CD 包合技术安全可靠。如果被包合客分子具有刺激性、不良气味，β-CD 包合技术还能降低刺激性和不良反应，同时掩盖客分子不良气味和提高临床服药依从性［11］。β-CD 包合技术还能将挥发油类物质制备成固体粉末，有利于将液体药物制备成固体制剂［12］。

肉桂挥发油包合工艺的早期研究方向主要集中在包合方法上，如研磨法、饱和水溶液法、超声法等，不同包合方法各有优缺点，实际生产应用中应根据被包合客分子性质、设备条件等选择合适的方法［13］。本研究选择饱和水溶液法进行肉桂挥发油包合，重点研究了包合影响因素的参数，为选出不同单因素的最优水平，考察了不同单因素的3 个水平的挥发油包合率、包合物收得率和工艺总评分，通过比对上述3 个评价指标，最终选出的最佳包合工艺为A1B2C2。根据最佳工艺制备的3 批次包合物的挥发油包合率、包合物收得率、总评分均与正交试验各项评价指标的最大值接近，验证结果说明本研究正交试验优选的工艺稳定可靠。为进一步验证包合效果符合预期结果，本研究对包合物分别进行了紫外扫描和薄层色谱的特征鉴别，实验说明挥发油被包合后并未发生性质改变，且肉桂挥发油被β-CD 完全包合，而不是简单的物理混合，紫外扫描显示空白挥发油、物理混合物及包合物的最大吸收波长均发生了红移。综上所述，本研究优化工艺制备的包合物出现了新的物相特征，且制备工艺稳定可靠。