HPLC 法测定岩鹿乳康胶囊中水晶兰苷的含量

赵俊雄，和祎

怒江傈僳族自治州食品药品检验所，云南 泸水 673199

中国云南滇西少数民族地区有着比较悠久的少数民族医药文化及传承历史，岩鹿乳康胶囊是基于彝族医药理论研究形成的经典名方，并具有民间用药经验及临床验证支持，在治疗胸胁、腹胀痛及妇女乳癖方面有较为显著的疗效而被滇西少数民族广泛使用。彝族医药是我国民族医药重要组成部分，彝族医药理论认为，岩鹿乳康胶囊功效为“补知凯扎诺，且凯色土”，可益肾，活血，软坚散结，主要用于治疗肾阳不足、气滞血瘀等导致的乳腺增生症［1］。该药是由岩陀、鹿衔草、鹿角霜组成的一种中药胶囊剂，现行质量标准WS-10306（ZD-0306）-2002-2011Z 仅对处方中的岩陀有效成分岩白素的含量进行了定量控制，但未对鹿衔草有效成分进行定量控制［2］。鹿衔草具有活血调经、祛风除湿、补虚益肾等功效，具有祛风湿、强筋骨、止血、止咳的功效，用于治疗风湿痹痛、肾虚腰痛、腰膝无力、月经过多、久咳劳嗽等［3］，是该药处方中的重要组成部分，为更全面有效地控制岩鹿乳康胶囊的质量，保证该品种用药安全有效，本研究采用HPLC 法测定岩鹿乳康胶囊中鹿衔草的主要有效成分水晶兰苷的含量。

1 仪器与试药

仪器：Agilent 1260 高效液相色谱仪（二极管阵列检测器，AgilentChemStation 色谱工作站）；分析天平（梅特勒托利多电子天平XS205DU，十万分之一）；分析天平（梅特勒托利多电子天平AE240，万分之一）。试药:岩鹿乳康胶囊(批号：20200602、20201203、20210201)样品生产企业为云南海沣药业有限公司；对照品为水晶兰苷（批号：111870-202004，供含量测定用，含量以96.5%计，来源为中国食品药品检定研究院）。自制阴性样品；甲醇(色谱纯，德国默克)；实验用水为超纯水；其他使用的试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱为Agilent EclipseXDB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：甲醇-0.1%磷酸溶液（5∶95），流速为1.0 mL/min；检测波长为235 nm，进样量10 μL，在当前色谱条件下理论塔板数为8 619。色谱图见图1。

图1 高效液相色谱图：A.对照品溶液；B.供试品溶液；C.阴性样品溶液

2.2 溶液制备

2.2.1 供试品溶液的制备 取样品内容物（《中国药典》四部通则中装量差异项下），先研细并充分混匀，取约0.4 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入纯水50 mL，称定重量，在80 ℃水浴锅中回流提取1 h，先放冷，再称定重量，然后用水补足所减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液20 mL，经旋转蒸发仪减压浓缩至干，往残渣中加适量水使充分溶解，溶解后完全转移至5 mL 容量瓶中，定容，摇匀，过滤，经0.45 μm 微孔滤膜滤过，即得。

2.2.2 对照品溶液的制备 精密称取水晶兰苷对照品10.48 mg，置100 mL 容量瓶中，加水溶解后并稀释至刻度，摇匀，即得每1 mL 中含水晶兰苷101.13 μg的对照品储备溶液。再精密量取对照品储备液1 mL置25 mL 量瓶中，加水稀释至刻度即得每1 mL 中含水晶兰苷4.045 2 μg 的对照品溶液。

2.2.3 阴性样品溶液的制备 精密称取按处方工艺不含鹿衔草的阴性样品，按照“2.2.1”项下方法制备阴性样品溶液。

2.3 线性关系的考察

精密吸取“2.2.2”项下的水晶兰苷对照品储备溶液1、2、2.5、3、4、6 mL，分别置于25 mL 量瓶中，加水定容制成浓度分别为4.045 2、8.090 4、10.113 0、12.135 6、16.180 8、24.271 2 ug/mL 的系列对照品溶液，分别吸取上述各浓度对照品溶液10 μL，按“2.1”项下相关条件分析，记录峰面积，以对照品进样量（ng）为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），绘制标准曲线，得出水晶兰苷回归方程Y=13.975X-2.576 7（r=0.999 7，n=6）,结果表明水晶兰苷的进样量在40.452～242.712 ng范围内呈良好的线性关系。

2.4 重复性试验

取岩鹿乳康胶囊，按照“2.2.1”项下方法平行制备供试品溶液6 份，每份分别取0.4 g，精密称定，按照“2.1”项下色谱条件进样10 μL 进行测定并计算，结果测得每粒岩鹿乳康胶囊中水晶兰苷的平均含量为0.12 mg，RSD=1.2%。

2.5 精密度试验

取“2.2.2”项下制备的对照品溶液，连续进样6 次，每次进样量为10 μL，记录峰面积，结果水晶兰苷峰面积的RSD 值为1.37%。结果表明，仪器精密度良好。

2.6 稳定性试验

按上述色谱条件取“2.2.1”项下制备的供试品溶液，分别在0，2，4，18，24 和30 h 分别进样10 μL 并测定峰面积，结果水晶兰苷峰面积的RSD值为0.96%，说明供试品溶液室温放置在30 h 内较为稳定。

2.7 回收率试验

取已知含量的同一批（批号：20210201）样品6份，各约0.4 g，精密称定，分别置于6个锥形瓶中，精密量取并加入上述锥形瓶中质量浓度为101.13 μg/mL 的水晶兰苷对照品溶液各1 mL，按“2.2.1”项下方法制备所需供试品溶液，分别测定供试品溶液中待测物的含量，计算并得出水晶兰苷的平均回收率为98.78%，RSD 为 0.61%（n=6），结果详见表1。

表1 回收率试验结果（n=6）

2.8 含量测定

按上述色谱条件，依法测定3 批样品中水晶兰苷的含量，结果见表2。

表2 样品含量测定结果（n=3）

3 讨论

3.1 化学成分的确定

经查阅相关文献得出［4-7］，黄酮类物质是鹿衔草中的主要成分，提取纯化工艺基本为醇提，但由于醇提黄酮类物质的工艺成本较高，导致在工业化生产中不太适用。故本试验采用以水为溶剂提取鹿衔草中化学成分，通过方法学验证，其有效成分水晶兰苷能被有效提取并分离，能达到《中国药典》规定的鹿衔草中水晶兰苷最低下限值［8］，所以本研究确定水晶兰苷为指标用于测定岩鹿乳康胶囊中鹿衔草的含量。

3.2 检测波长的确定

为了保证水晶兰苷的测定能有较好的灵敏度，根据高效液相色谱二极管阵列检测器上测得的紫外吸收光谱图以选择水晶兰苷的检测波长。以甲醇-0.1%磷酸溶液（5∶95）为溶剂制备对照品溶液，经检测该溶液在235 nm 处有最大吸收，所以选择检测波长为235 nm。

3.3 流动相的确定

水晶兰苷是一种偏酸性化合物，经考察在磷酸缓冲溶液条件下才能得到理想的分离效果［9］。故在流动相的选择与确定方面，首先采用了乙腈-0.1%磷酸溶液（15∶85）进行试验，结果待测成分存在分离不好的情况。当流动相以甲醇-0.4%磷酸水溶液（15∶85）、甲醇-0.1%磷酸水溶液（5∶95）两种不同浓度及比例的磷酸水溶液流动相分别进行考察时，结果发现两种流动相的检测结果显示水晶兰苷的分离效果较好，含量测定结果重复性好，基线比较平稳，色谱峰形状对称，能达到《中国药典》规定要求，然而随着磷酸浓度的不断增大,分离效果却未能有明显的改善，需充分考虑分离效果及色谱柱的PH 耐受范围，故确定甲醇-0.1%磷酸溶液（5∶95）作为流动相。

3.4 样品的提取方法确定

提取溶剂选择方面，分别考察了40%甲醇、70%甲醇、90%甲醇和水等多种溶剂，结果表明采用水作为提取溶剂时有效成分水晶兰苷的提取效果较好且能被较好分离，故采用水为该方法的提取溶剂。最佳提取方式选择方面，本研究曾分别考察回流提取、超声提取两种提取方式，有效成分水晶兰苷的提取结果表明采用回流提取效果最佳；在回流提取温度和时间的选择和确定方面，经考察多种回流温度及时长,结果表明在80 ℃回流提取1 h的条件下效果最佳。

4 结论

鹿衔草含量测定项目在岩鹿乳康胶囊原质量标准中的缺失，导致该药品的质量不能进行较好地控制。为使处方中鹿衔草中有效成分含量测定方法与《中国药典》2020 年版一部中鹿衔草中水晶兰苷的质量控制一致，最终确定采用HPLC 法测定岩鹿乳康胶囊中水晶兰苷的含量，并通过了方法学验证，该研究方法学验证下的各项指标都能达到定量测定的相关要求。

综上所述，该研究方法操作简单，结果稳定且可靠。因此，本方法可用于岩鹿乳康胶囊中水晶兰苷的含量测定，以此来进一步控制岩鹿乳康胶囊的质量。