槲皮素脂质纳米粒冻干粉末体外稳定性及肝癌细胞毒性研究

苗方，马兰

菏泽医学专科学校，山东 菏泽 274000

槲皮素（Quercetin，Que）具有明确的抗癌、抗炎作用［1-2］，但因其具有低水溶性、低生物利用度以及化学稳定性较差的劣势，在临床应用中受到了极大的限制［3］。纳米技术的出现为槲皮素提供了前所未有的发展空间，为许多疏水性药物提高溶解度和生物利用度提供了有效的方法。槲皮素制备成纳米颗粒并经由纳米载体递送之后，具有极高程度的抗癌潜力，在临床应用中拥有一定治疗前景，受到各界的广泛关注［4］。纳米制剂常用于提高药物溶解度、吸收、循环、滞留时间以及体内分布特异性的各种递药系统，包括自乳化乳剂、纳米颗粒、脂质载体、胶束、包合物等，这些技术皆能够提高槲皮素的生物利用度与稳定性，极大地提高了槲皮素的临床应用价值［5-7］。

固体脂质纳米粒（solid lipid nanoparticles，SLN）是采用适当的方法，将脂质材料制备成纳米粒子，将疏水性药物包裹或嵌合于脂质核中用以提高溶解度，且通过生理因素增加纳米粒子在体内靶部位的蓄积。纳米脂质载体在用于递送抗癌药物时具有诸多显著的优点，如较好的物理化学稳定性、较高的载药量和包封率、可控的药物释放行为、优良的靶向性及工业化生产的可行性［8-10］，故将槲皮素结合脂质纳米粒技术进行研究，可充分发挥槲皮素应有的治疗潜力。

虽然有关槲皮素纳米递药系统的报道较多，但有关槲皮素的体外稳定性研究依然较少，本研究制备包载槲皮素的脂质纳米粒（SLNs/Que），对其冻干粉末的稳定性进行相关制剂学评价以及体外抑制肝癌细胞的作用研究，为槲皮素临床制剂的基础开发提供一定的参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器

电子天平（ME204E，METTLER TOLEDO，瑞士）；集热式磁力搅拌器（DF-101S，上海秋佐科学仪器有限公司）；超声波清洗仪（SB-5200D，张家港市科宇信超声有限公司）；动态光散射仪（Zetasizer nano ZSP，Malvern，英国）；高效液相色谱仪（L-2000，桂林伯乐马科技有限公司）；超声波细胞粉碎机（SFX250，EMERSON，美国）；CO2细胞培养箱（MCO-18AC，SANYO，日本）；酶标仪（Synergy H1，Bio Tek，美国伯腾仪器有限公司）。

1.2 试药

槲皮素（质量分数＞98%，上海纯优生物有限公司）；大豆卵磷脂（质量分数＞95%，上海绿都实业有限公司）；吐温80（国药试剂有限公司）；香豆素（C6，大连美仑生物有限公司）；四甲基偶氮唑蓝（上海钰森生物技术有限公司）；优级胎牛血清（四季青生物工程公司）；RPMI-1640 培养基（上海sigma-aldrich）；其他分析纯及色谱纯有机试剂均购于国药试剂有限公司。

2 方法

2.1 脂质纳米粒的制备

SLNs/Que 的最佳工艺（已在前期研究中确定使用热熔乳化超声分散法）：70 ℃水浴加热搅拌条件下，将已确定用量的槲皮素和单硬脂酸甘油酯溶解于无水乙醇中，作为油相；将已确定用量的大豆卵磷脂和吐温80 溶解于纯化水中，作为水相；保持温度不变，在搅拌下，以10 mL/min 恒速地将水相溶液分散于油相溶液中；同时采用超声波处理器处理混合溶液（时间为3 min，功率为400 w，工作与间歇各2 s），制成乳白色的初乳；超声结束后放置于25 ℃水浴降温，过0.45 μm 微孔滤膜，即得淡蓝色透明的SLNs/Que 溶液。将制备的SLNs/Que 溶液加入10%甘露醇，分装于西林瓶中，冷冻干燥后得到SLNs/Que 粉末。将粉末经注射用水复溶后，得到SLNs/Que 冻干粉末复溶溶液。空白SLNs 冻干粉末亦采用上述方法制备。

2.2 槲皮素体外分析方法建立

配置质量浓度在2.0 µg/mL～12.0 µg/mL范围的系列槲皮素标准品溶液，查阅相关文献，采用紫外可见分光光度法测定槲皮素溶液的吸光度（375 nm波长），将槲皮素溶液浓度和吸光度值分别作为横坐标（X）和纵坐标（Y），对其进行线性回归分析［11］。分别取2.0、8.0、12.0 µg/mL 的槲皮素标准品溶液作日内和日间精密度。精密量取白色的SLNs/Que冻干粉末，采用无水乙醇破乳后，配置成9 份供试品溶液，每份加入不同质量的槲皮素标准品（每份1 mL，分别加入0.4 mg、0.5 mg 和0.6 mg，各3 份），稀释定容后，测定加样回收率。

2.3 SLNs/Que 包封率和载药量测定

精密移取制备好的SLNs/Que溶液，15 000 r/min离心20 min，沉淀的纳米粒用无水乙醇破乳后，紫外可见分光光度法测定吸光度值（375 nm），按公式（1）和（2）计算得包封率和载药量。

2.4 稳定性检查

将SLNs/Que 溶液及SLNs/Que 冻干粉末贮藏于干燥器中，分别于0、30、60、90 d 取样，对SLNs/Que 溶液及SLNs/Que 冻干粉末复溶溶液进行观察。使用激光粒度仪测定粒径和zeta电位。按“2.3”项下方法，测定并计算载药量和包封率。

2.5 体外释放行为考察

采用透析法测定SLNs/Que 的体外释放行为。精密量取0、30、60 和90 d 冻干粉末复溶的SLNs/Que溶液、未冻干的SLNs/Que 溶液和游离槲皮素溶液各6.0 mL，装入处理好的透析袋，两端扎紧，浸入含1%吐温80（v/v）pH 7.4 磷酸盐缓冲液的200 mL 溶出介质中，进行体外释放检查（37±0.5 ℃，100 r/min）。在相应的透析取样时间点，分别吸取2.0 mL 释放介质（同时补加同体积同温度的溶出介质），采用紫外可见分光光度法测定槲皮素浓度。将计算后的槲皮素累计释放百分率绘制成体外释放曲线。

2.6 四甲基偶氮唑蓝比色法测定细胞活力

HepG2 细胞培养于37 ℃，5%CO2和饱和湿度环境下含5%胎牛血清、100 U/mL 青霉素、100 μg/mL链霉素的RPMI-1640 细胞培养液中。将细胞悬液，接种于96 孔板（2×104个）中。培养过夜，弃去培养液。设定空白对照组（为细胞培养液）、空白制剂组（为培养液+不同浓度空白SLNs 溶液）、游离药物组（为培养液+不同浓度游离槲皮素溶液）、给药制剂组（为培养液+不同槲皮素浓度的SLNs/Que溶液），加样（各组100 μL）。分别孵育48 和72 h 后，每孔加入25 μL 四甲基偶氮唑蓝溶液（5 mg/mL）处理，测定各孔的光密度OD 值（λ=490 nm），按以下公式（3）计算细胞存活率（以不加药物的空白细胞为对照组），并计算IC50值。

2.7 统计学方法

数据均采用SPSS 18.0 统计，P＜0.05 表示差异有统计学意义。

3 结果

3.1 槲皮素体外分析方法建立

采用紫外可见分光光度法建立槲皮素体外分析方法，线性回归方程为Y=0.124X+0.062 2，r=0.999 5。结果表明，槲皮素在特定的范围内（2.0µg/mL～12.0 µg/mL）质量浓度与吸光度呈良好线性。见图1。高、中和低三种浓度测定的日内精密度和日间精密度的RSD 均小于2.0%，表明测定方法的日间和日内精密度良好。测定方法的加样回收率结果分别为96.28%、95.47%和101.3%（n=3），表明SLNs辅料对槲皮素含量的测定无影响。

图1 槲皮素质量浓度与吸光度线性回归图

3.2 SLNs/Que 的制剂学性质

考察热熔乳化超声分散法最佳工艺制备SLNs/Que 溶液及SLNs/Que 冻干粉末复溶溶液的制剂学性质，结果如表1 所示。研究结果表明，SLNs/Que 溶液和冻干后60 d 内的复溶溶液，其外观形态均为透明澄清、粒径、zeta 电位、包封率和载药量无变化，但冻干后90 d 的复溶溶液，可观察到外观浑浊，且呈现一系列不稳定现象如包封率与载药量明显降低、粒径增大、Zeta 电位降低。

表1 SLNs/Que溶液及SLNs/Que冻干粉末复溶溶液的制剂学考察结果（）

表1 SLNs/Que溶液及SLNs/Que冻干粉末复溶溶液的制剂学考察结果（）

3.3 SLNs/Que 的体外释放性质研究

不同制剂组槲皮素的累计释放曲线如图2 所示，游离槲皮素组2 h 的累计释放量高达（86.7±3.43）%，4 h 的累计释放量达到了90%以上；SLNs/Que 冻干粉末90 d 的复溶溶液组2 h 的累计释放量为（65.6±6.23）%，12 h 的累计释放量达到了90%以上；而SLNs/Que 溶液组、冻干粉末的复溶溶液组（0 d、30 d、60 d）的累计释放曲线相似，累计释放量基本相同，无显著的凸释现象，且均呈现了较好的缓释效果，48 h 的累计释放量达到90%，基本释放完全。

图2 体外释放曲线（n=3）

以上结果表明，SLNs/Que 冻干粉末保存60 d的复溶溶液与新制备的SLNs/Que 溶液的制剂学性质及体外释放行为基本一致，后续采用保存60 d 内的SLNs/Que 冻干粉末复溶溶液进行相关实验。

3.4 体外细胞毒性研究

采用四甲基偶氮唑蓝比色法测定SLNs/Que 对HepG2 细胞的毒性作用。不同浓度空白SLNs 组细胞的生存率均大于90%，表明空白SLNs 对HepG2细胞几乎无毒性作用，空白载体材料安全性较高。不同浓度的空白SLNs 对HepG2 细胞处理不同时间后的细胞存活率如图3 所示。

图3 HepG2经空白SLNs处理48 h和72 h后的细胞存活率（n=5）

HepG2 细胞经SLNs/Que 和槲皮素原料药处理不同时间后的细胞存活率如图4 所示。结果表明，随着槲皮素原料药浓度增加，其对细胞的毒性也增加。HepG2 细胞经SLNs/Que 和槲皮素原料药处理后48 h和72 h的IC50值如表2所示。48 h和72 h时，SLNs/Que 的IC50分别降低57.73%和76.27%。与槲皮素原料药的IC50相比，将槲皮素制成固体脂质纳米粒后IC50明显降低，差异有统计学意义。结果表明，通过脂质纳米粒包载后，槲皮素对HepG2 细胞毒性作用增强。

图4 HepG2细胞经SLNs/Que和槲皮素原料药处理48 h（A）和72 h（B）后的细胞存活率（n=5）

表2 SLNs/Que和槲皮素原料药的IC50（）

表2 SLNs/Que和槲皮素原料药的IC50（）

4 讨论

由于槲皮素在水中溶解度较低，且体内的分布不具有特异性，因此导致其临床应用受到了极大的限制。本研究采用热熔乳化超声分散法制备的SLNs/Que 脂质纳米粒，改善以上不足的同时，兼具控制槲皮素缓慢释放的作用，且更易于工业化生产［12］。SLNs/Que 是以脂质为骨架材料，卵磷脂及吐温80 为乳化剂制备的纳米实心小球。对于微粒分散体系来说，适宜的粒径除了利于制剂的体外稳定性，还能决定微粒在体内的分布行为，最终对制剂的靶向效果产生一定的影响。由于槲皮素分散于脂质骨架材料中，在释放过程中，以扩散的方式来实现相对缓慢的释放，维持体内稳定的血药浓度。最终结果显示，本研究制备的脂质纳米粒在保存90 d后，其冻干粉末的稳定性下降明显，可能与冻干保护剂甘露醇的用量有关［13-14］，今后将对此问题进行进一步的研究与探讨。