基于网络药理学与分子对接探讨黄莪胶囊治疗良性前列腺增生症的作用机制研究*

郭 俊晏 斌杜冠潮赵 丰邓楹君王 浩高庆和郭 军**

1.中国中医科学院西苑医院（北京 100091）；2.北京中医药大学（北京 100029）

良性前列腺增生症 （benign pr ostatic hyperplasia，BPH）是导致中老年男性出现排尿障碍的最常见的疾病，该病的主要临床表现包括前列腺体积的增大与下尿路症状[1]。该病属中医“精癃”、“癃闭”范畴[2]。BPH的患病率随着男性年龄的增长而明显升高。现代医学的药物治疗以α受体阻滞剂和5α还原酶抑制剂为主。中医药治疗具有多靶点调控与个性化诊疗的特点，在BPH的治疗上具有一定优势。其中，黄莪胶囊作为治疗BPH的常用上市中成药，具有益气活血、清热利湿的功效，可降低BPH患者IPSS评分，提升生活质量，减小前列腺体积，改善最大尿流率[3]。

复方中药对于疾病的治疗是基于其多成分的特点，从多个靶点与通路进行调节。网络药理学是将医学、大数据科学、生物信息学等多学科进行交叉融合，以反映药物对于疾病的干预机制的方法。本次研究利用网络药理学与分子对接方法，以探究黄莪胶囊对于BPH的作用机制，为后续的研究提供参考。

方 法

一、黄莪胶囊相关靶点的筛选

应用中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP，Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform）分别检索黄莪胶囊中12味中药的有效成分。在TCMSP中，ADME（Absorption，Distribution，Metabolism，Excretion）属性值分别选用药物口服利用度（OB）≥30%、类药性（DL）≥0.18作为黄莪胶囊有效成分的统一筛选标准。根据已发表的文献对于12味中药的有效成分进行补充，并将补充获取的有效成分在TCMSP中再次检索，确保有效成分符合统一筛选标准。通过TCMSP检索并收集黄莪胶囊中12味中药有效成分所对应的蛋白质靶点信息。下载Uniport数据库[4]中已验证的人类蛋白质与基因信息，并将所收集的蛋白质靶点信息进行标准化处理为统一的基因名。

二、BPH靶点的获取

以“benign prostatic hyperplasia”、“benign prostatic hypertrophy”、“BPH”等为关键词，在GeneCards[5]、OMIM、TTD数据库中搜索并获得与BPH相关的靶点。GeneCards数据库中以Relevance score量化靶点与疾病的关系，若该数据库中靶点信息过多，则以大于Relevance score的中位数值为筛选标准，筛选出相关性更高的靶点。将三大数据库中的靶点信息进行合并且去除重复值，得到与BPH相关的靶点信息。

三、黄莪胶囊PPI（protein-protein interaction）网络的构建

旨在了解黄莪胶囊药物成分的相关靶点与BPH靶点的相互作用关系，故利用R软件，将上述得到的黄莪胶囊靶点与BPH相关靶点相映射，取二者交集，得到黄莪胶囊治疗BPH的潜在作用靶点并绘制韦恩图。将潜在作用靶点导入STRING平台[6]，将蛋白种类设置为“Homosapiens”，最小互相作用阈值设定为“highest confidence”＞0.9，其余条件均为默认设置，构建黄莪胶囊治疗BPH的PPI网络。

将基于STRING平台得出的PPI网络数据导出，利用Cytoscape 3.8.2软件[7]进行PPI网络的图形绘制，利用Cytoscape中Analyze Network的功能对于PPI网络进行拓扑得出等级值（degree）、紧密中心度（Closeness Centrality）、邻域连通性（Neighborhood Connectivity）与介数中心性（Betweenness Centrality）等，按照degree进行排序，并按照degree值的大小设置节点大小、颜色；按照蛋白与蛋白互作联系的紧密性设置连线的颜色、粗细，最终将黄莪胶囊治疗BPH的核心靶点的PPI网络进行可视化呈现。

四、富集分析

Metascape平台是功能强大的基因功能注释分析工具，该平台数据更新速度快，覆盖多个权威数据库，可对基因或蛋白质进行批量注释与分析[8]。

将黄莪胶囊治疗BPH的核心靶点数据导入至Metascape平台，对其进行基因本体（Geneontology，GO）功能和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析，其中GO分析包括BP（biological process）、CC（cellular component）、MF（molecular function）。将数据库与基因集的物种限定为“Homosapiens”，阈值设置P＜0.01。并将数据结果导入至R软件中，分别以柱状图与气泡图的形式呈现。

五、药物-成分-靶点-通路网络的构建

运用Cytoscape 3.8.2构建黄莪胶囊成分-靶点-通路网络图，利用内置工具Network Analysis功能进行网络拓扑属性分析，依据连接度（Degree）、介度（Betweenness Centrality）及紧密度（Closenesss Centrality）等判断核心成分、靶点与通路之间的关系。

六、分子对接验证

选择黄莪胶囊成分-靶点网络图中degree排名前5的靶点，在PDB数据库筛选其PDB ID，并下载靶点的3D结构，运用PyMOL软件对结构进行去除水分子、去除磷酸根等操作。再应用AutoDockTools 1.5.6及AutoDock Vina软件[9]对degree排名前3的化合物分子进行对接，并计算对接能量。

结 果

一、黄莪胶囊治疗BPH潜在靶点的获取

通过筛选，黄莪胶囊的12味中药共获得85个活性成分；获取黄莪胶囊作用靶点286个，BPH靶点986个。利用R软件，将上述黄莪胶囊靶点与BPH靶点进行映射，如图1所示，得到133个黄莪胶囊治疗BPH的潜在靶点。

图1：黄莪胶囊成分-BPH靶点韦恩图

二、PPI网络分析

如图2所示，黄莪胶囊用于BPH治疗中相关度较高的靶点为肿瘤抑制因子p53、丝裂原活化蛋白激酶1（mitogen-activated protein kinase1，MAPK1）、肾上腺素能受体α1a（adrenoceptor alpha 1A，ADRα1a）、蛋白激酶B1（protein kinase B1，pkb1/AKT1）、内皮素1（Endothelin-1，ET-1）、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF)、雄激素受体（androgen receptor，AR）、内皮型一氧化氮合酶（nitric oxide synthase 3，NOS3)、转化生长因子β1（transforming growth factor-β1，TGFβ1）、雌激素受体1（estrogen receptor 1，ESR1）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（caspase-3，CASP3）、表 皮 生 长 因 子 受 体（epidermal growth factor receptor，EGFR）等。其中，相关度排名前10的靶点见表1。

表1 黄莪胶囊核心靶点靶点网络节点特征参数

图2 黄莪胶囊干预BPH的潜在靶点PPI网络

三、GO功能、KEGG通路富集分析及药物成分-靶点-通路网络图

GO分析得到分子功能145个，生物过程2173个，细胞组分74个。前20条GO分析结果如图3所示，主要涉及凋亡信号通路转导 （regulation of apoptotic signaling pathway）、氧化 应激 （response to oxidative stress）等过程。

图3 黄莪胶囊干预BPH潜在靶点的GO分析结果

KEGG分析共得到322条具有显著意义的通路，前20条与BPH相关度较高的通路如图4所示，主要包括抗肿瘤、促进凋亡、抑制炎症等。

图4 黄莪胶囊干预BPH潜在靶点的KEGG分析结果

药物成分-靶点-通路网络如图5所示。依据degree值筛选出排名前3的化合物分子，见表2。

图5 黄莪胶囊药物成分-靶点-通路网络图

表2 黄莪胶囊主要有效成分靶点网络节点特征参数

四、分子对接预测黄莪胶囊活性成分与潜在靶点的结合能力

对黄莪胶囊药物成分-靶点-通路网络分析中得出的核心有效成分槲皮素、山奈酚、β-谷甾醇与关键靶点p53、MAPK1、ADRα1a、AKT1、ED-1进行分子对接。若结合能＜0 kcal·mol-1，则配体小分子可和受体蛋白自发结合，若结合能＜-5.0 kcal·mol-1，表明其结合性好，小于-7.0 kcal·mol-1结合活性较强，结合能越小对接越好[10]。对接结果见表3。93.3%的有效成分与靶点蛋白结合较好，20%的有效成分与靶点蛋白结合较强，其中β-谷甾醇与MAPK1的结合最好。利用PyMOL对成分与靶点对接后的分子表面结构与棍状结构进行可视化呈现，以结合程度最高的β-谷甾醇与MAPK为例进行展示，结果见图6、图7。

表3 黄莪胶囊中有效成分与核心靶点结合能预测

图6 β-谷甾醇与MAPK1结合的分子表面结构

讨 论

中医虽无BPH的病名，但在古籍中早有记载，当属于“癃闭”、“精癃”的范畴。《素问·宣明五气篇》曰：膀胱不利为癃，不约为遗溺。《类证治裁·闭癃遗溺》曰：闭者小便不通，癃者小便不利。气虚、瘀血、湿热为该病的主要致病因素[11]。病变位于肾与膀胱，证属本虚标实，益气活血，清热利湿法是BPH的重要治法。

黄莪胶囊以黄芪、桃仁为君药，黄芪甘温，为补气之要药，既可益气固表、利尿消肿，亦能助气行血以化瘀；桃仁入膀胱经，功善祛瘀。“气为血之帅，血为气之母”，黄芪与桃仁相伍，益气活血，互增效用。臣药莪术、大黄、益母草均有活血散结之用；土茯苓祛湿热，亦有入络之功；夏枯草乃散结常用之品，兼有和阳养阴之能。佐药北豆根可助土茯苓清热利湿；肉桂温热之性既可助膀胱气化以祛瘀，亦能防全方苦寒太过。使药牛膝利尿通淋，且能引血下行，使药可直达病所。全方共奏益气、活血、散结、利湿之用。

一、潜在有效成分分析

本次研究发现共获得85个活性成分，作用靶点286个，将最终数据导入Cytoscape3.8.2中，利用Analyze Network计算活性成分的节点值，发现黄莪胶囊中degree最高的有效成分包括槲皮素（quercetin）、山柰酚（kaempferol）、β-谷甾醇（beta-sitosterol）与芦荟大黄素（aloe-emodin）等。

槲皮素与山奈酚均为天然黄酮类化合物。其中，槲皮素多从植物中提取，具有多重生物活性，有降低氧化应激、抗炎等作用[12]。A.Ghorbanibirgani通过随机双盲试验，应用槲皮素对BPH患者进行干预发现，槲皮素与安慰剂相比，可明显降低前列腺症状评分，提升尿流率[13]。山奈酚又称为山萘黄素、山奈素等，具有抗氧化、抗炎、抗癌等多种药理活性。山奈酚可抑制双氢睾酮诱导的雄激素受体的转录活性、PSA和AR基因的表达以及LNCaP、BPH-1细胞的增殖，明显降低BPH大鼠前列腺指数，改善BPH大鼠的病理性质[14]。β-谷甾醇作为植物甾醇的一种，存在于众多植物的细胞膜中，有降血脂、抗炎、抗肿瘤的作用[15]。Cosentino V等让BPH患者连续3月，每隔3天服用一次含有β-谷甾醇的膳食补充剂，发现患者IPSS评分降低与尿流量的显著增加[16]。芦荟大黄素作为蒽醌类化合物有抗前列腺增生作用，可显著降低BPH模型小鼠的前列腺系数[17]。

通过分子对接发现黄莪胶囊中的核心有效成分槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇、芦荟大黄素与关键靶点（p53、MAPK1、ADRα1a、AKT1、ED-1）的结合活性较好，这也反应了预测的可靠性。

二、靶点分析

由于BPH的主要增生部位前列腺基质的组成以平滑肌为主，富含大量α1肾上腺素受体（αadrenoceptor，α1-AR）。当交感神经兴奋后，去甲肾上腺素作用于α1-AR致平滑肌收缩，而出现动力性梗阻。黄莪胶囊对α1-AR存在竞争性拮抗作用[18]，以降低尿道平滑肌张力，缓解后尿道压力以改善排尿症状。AKT1是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，在PI3K的激活下参与调控各种细胞功能，包括正常和恶性细胞的增殖、生存、代谢和血管生成[19]。研究发现AKT基因的过表达和前列腺体积的增大有关[20]。ET-1可介导前列腺平滑肌收缩，导致动力性梗阻症状的出现；董佳晨通过对空白组、模型组、黄莪胶囊高、低剂量组大鼠前列腺组织中内皮素进行免疫组化染色，发现ET-1在黄莪胶囊高、低剂量组中表达较模型组明显降低，发现黄莪胶囊可降低ET-1在BPH组织中的表达水平[21]，改善尿道出口梗阻的症状。

三、生物富集分析

通过GO功能富集分析可知，生物学进程包括凋亡信号通路、氧化应激反应、蛋白磷酸化正调控、对生长因子的反应等，主要涉及蛋白激酶活性、激酶绑定、转录因子绑定、信号受体调节活性等方面的功能。

依据KEGG富集分析结果，并结合黄莪胶囊的前期实验研究及目前BPH研究进展，笔者认为PI3K-Akt信号通路、IL-17信号通路、FoxO信号通路可能是黄莪胶囊治疗BPH的主要作用通路。

PI3K（Phosphoinositide-3 kinase）属于磷脂激酶家族，是肌醇及磷脂酰肌醇的主要激酶。AKT（Protein kinase B）是PI3K下游信号通路中最为重要的一个蛋白，它是一种丝/苏氨酸蛋白激酶。该信号通路调节细胞的增殖、分化、凋亡[22]。Karli Sreenivasulua通过q-PCR评估27名年龄在55岁至75岁之间的BPH患者前列腺组织中PI3K和AKT的基因表达水平，发现其表达随着前列腺体积的增加而显著增加[20]。故预测PI3K/AKT通路的过表达会导致BPH中细胞凋亡减少从而导致前列腺体积的增大。

FoxO信号通路中，FoxO亚家族可促进细胞凋亡、抑制细胞周期进程和自噬[23]。Dey Strom和Gustafsson指出雌激素受体-β可以通过增加FoxO3a的转录，通过caspase-9途径促进前列腺癌细胞的凋亡[24]。李琦等观察到使用苦参碱抑制前列腺癌细胞增殖后FoxO1a、FoxO3a、FoxO4和FoxO6的表达显著增加[25]，表明苦参碱可能通过FoxO信号通路抑制前列腺癌细胞的增殖并诱导细胞凋亡。虽然FoxO信号通路在前列腺增生方面的相关研究较少，但是以上结果表明FoxO信号通路可能在前列腺细胞增殖、凋亡和细胞周期中起到重要作用。

白细胞介素（IL-17）是新型炎症细胞因子家族的创始成员。虽然IL-17的促炎特性是其宿主保护能力的关键，但不受限制的IL-17信号传导自身免疫性疾病和癌症进展有关[26]。在IL-17信号通路中，促炎性因子IL-17的表达升高会刺激IL-6和IL-8的多倍增长，IL-6和IL-8会促进BPH基质生长[27]。

综上所述，黄莪胶囊中的槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇、芦荟大黄素等有效成分可能通过作用于p53、MAPK1、ADRα1a、AKT1、ET-1靶 点，调 控PI3K-Akt、FoxO、IL-17等信号通路，抑制前列腺细胞增殖、缓解后尿道压力而治疗BPH。