陆地棉主要育种性状SSR 关联位点的验证及优异材料鉴定

张素君，李兴河，王海涛，唐丽媛，蔡肖，刘存敬，张香云，张建宏

（河北省农林科学院棉花研究所/ 农业部黄淮海半干旱区棉花生物学与遗传育种重点实验室/ 国家棉花改良中心河北分中心，石家庄 050051）

棉花是中国种植业生产中产业链最长的大田经济作物，除了主产品棉纤维外，棉秆、棉籽等副产品均已被利用， 其商品率高达95%以上[1-2]。其中陆地棉贡献了全部棉花产量的90%左右[3]，陆地棉品种的改良对棉花产业的发展具有重大推动作用。

陆地棉纤维产量与品质性状之间存在连锁累赘，传统育种方法难以实现产量与纤维品质等目标性状的同步改良[4-5]，同时，黄萎病作为我国棉花生产中最严重的病害之一，防治的主要策略仍是选育和推广抗病性好的棉花品种[6-7]。 因此，培育集产量高、纤维品质优、黄萎病抗性好于一体的棉花品种成为促进棉花产业发展的重要课题。通过挖掘与棉花产量、品质和抗性性状主效基因连锁的分子标记，并将分子标记应用于棉花分子标记辅助选择育种[8]，是聚合优异基因的有效途径。

目前，棉花上已经有大量的与目标性状关联的数量性状位点（quantitative trait locus,QTL）被挖掘到。例如，Wang 等[9]鉴定出13 个与纤维品质相关的QTL，与纤维长度、断裂比强度、马克隆值、断裂伸长率和长度整齐度指数相关的分别有2、4、2、2 和3 个， 其中9 个QTL 是首次鉴定。Muhammad 等[10]鉴定出165 个与纤维品质相关的QTL， 其中，47 个QTL 在多个环境下稳定存在。 Gu 等[11]鉴定到36 个与纤维品质和产量性状相关的稳定存在于8 个环境中的QTL，包含了4个新发现的主效QTL， 并鉴定了7 个候选基因。Li 等[12]利用4 个F2分离群体定位到50 个QTL，其中与纤维品质、 产量及株高相关的分别有27，16 和7 个。 Huang 等[13]定位到117 个与农艺性状相关的QTL， 其中11 个与多个性状相关。Wang 等[14]鉴定了28 个与衣分相关的QTL，其中3 个在多个环境下都能检测到。 Rashid 等[7]鉴定了40 个与黄萎病抗性相关的QTL，21 个可在多个环境下检测到。 Wang 等[15]利用染色体片段导入系鉴定了42 个与黄萎病抗性相关的QTL，并发现At 亚基因组对棉花黄萎病抗性的影响强于Dt 亚基因组，可用于加速棉花抗性育种进程。 Ning等[16]检测到7 个与黄萎病抗性相关的QTL，其中qVW-D9-1位点与黄萎病广谱抗性关联。 Palanga等[17]检测到119 个与黄萎病抗性相关的QTL，分布于25 条染色体上。 综合目前研究进展，已获得了大量与棉花纤维品质、产量、农艺性状、抗病性关联的QTL 位点，为基因克隆、分子标记辅助育种工作提供了宝贵信息。 牛豆豆等[18]利用与已经定位到的5 个与纤维强度相关的QTL 紧密连锁的SSR 标记在BC9F2、BC9F2:3群体中进行分子标记辅助选择效果检测及不同QTL 间聚合效应检测，发现单标记辅助选择效果明显，说明分子标记在棉花育种中应用前景较好。 但整体上看，直接应用于棉花辅助选择的标记较少[19]，限制了棉花的分子育种进程。

在其他作物上，已经针对分子标记利用开展了大量的工作。 Cui 等[20]首次报道了苦瓜基因组插入缺失突变（insertion-deletion mutation,InDel）标记的开发，这些分子标记为后续苦瓜的分子标记辅助选择育种工作奠定了基础。 张红等[21]从大白菜A07 号染色体上开发了1 个与抗干烧心病相关的分子标记BrIDCRT07， 在F2群体的吻合率达86.8%，在BC1F1群体的吻合率达94.9%，该分子标记可用于今后大白菜抗干烧心种质资源的辅助筛选工作。 张颖等[22]明确了ms6-dCAPS-3标记可将杂交大豆ms6后代分离群体中纯合可育、杂合可育和纯合不育单株准确区分，为ms6核不育基因在杂交大豆育种中的应用提供了有效的技术支撑。 陈豆豆等[23]证实了简单重复序列（simple sequence repeat, SSR）标记p3VvAGL11和5UVviAGL11可以用于无核葡萄种质的检测。吴晓军等[24]证实了抗旱性基因Dreb-B1分子标记的有效性，为小麦抗旱育种提供了有益信息。 姚姝等[25]利用不同群体比较了8 个与水稻条纹叶枯病抗性基因Stv-bi连锁的标记的选择效率， 获得了2 个可以高效筛选条纹叶枯病抗性材料的特定序列扩增（sequence characterized amplified regions,SCAR）和序列标记位点（sequence-tagged site,STS）标记。 任海红等[26]利用搜集到的48 份大豆材料对19 对SSR 分子标记进行实用性验证， 证明Satt162 和GNE165 分子标记联合检测可以应用于分子标记辅助高油大豆育种。 刘春晓等[27]利用50 个苹果栽培品种对4 个与抗炭疽菌叶枯病基因（Rgls）位点紧密连锁的分子标记的准确性进行验证，表明4 个分子标记验证苹果炭疽菌叶枯病抗性的准确率均在90%以上，可用于相关性状筛选。 尚小红等[28]基于木薯块根肉质颜色性状开发了1 个八氢番茄红素基因PSY2的酶切扩增多态性序列 （cleaved amplified polymorphic sequences, CAPS）标记，此标记选择准确率高达100%，该发现对分子标记辅助选育食用型木薯品种具有重要意义。

获得直接用于种质资源鉴定的功能标记位点，将快速推进分子辅助育种的进程。 本团队前期利用关联分析挖掘了多个环境下与纤维品质、 产量、黄萎病抗性关联的SSR 位点[29-31]，本研究选取了26 个在多个环境下与产量、 纤维品质、 抗病性关联的SSR 关联标记，在474 份陆地棉中验证鉴定其表型效应，筛选可用的标记位点，并根据表型效应挖掘优异典型材料，为棉花分子辅助育种提供依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

陆地棉材料共计474 份，其中130 份材料根据之前关联分析[29-31]结果筛选，344 份材料为近年搜集的各类资源、育种品系及审定品种（附表1）。

1.2 田间试验设计与性状调查及测定

1.2.1田间试验设计。 2019 和2020 年分别在河北邢台试验田和石家庄小安舍试验站种植鉴定。随机区组试验设计， 设2 行区， 行长6 m， 行距0.75 m，株距0.3 m，理论密度45 000 株·hm－2，2次重复，常规田间管理。

1.2.2性状调查及测定。9 月10－11 日随机取棉行中间20 株调查株高（plant height,PH）、单株果枝数（fruit branch number per plant, FBN）和单株铃数（boll number per plant, BN），8 月20－21 日鉴定黄萎病发病情况，每重复取中间行20 株，感病对照为冀棉11，利用相对病情指数（relative disease index,RDI）（病指）评估各个材料的抗病性强弱[32]，计算公式如下：

RDI＝DI×K（1）

DI＝∑（各病级株数×相应病级）/（调查总株数×最高病级（4））×100 （2）

式中，DI为被鉴定材料的病情指数，K为校正系数，K＝50/ 感病对照实际病指，并要求K值在0.75 至1.25 之间。

9 月25 日―10 月1 日选收正常吐絮中部棉铃30 个，考种获得铃重（boll weight,BW）和衣分（lint percentage, LP）数据，并在农业农村部棉花品质监督检验测试中心测定纤维品质，检测指标包括纤维上半部平均长度 （fiber upper half mean length,FUHML）、断裂比强度（fiber strength,FS）、马克隆值 （micronaire value,MV）、 断裂伸长率（breaking elongation, FE） 和长度整齐度指数（uniformity index,FU）。

1.3 SSR 标记来源

从前期关联分析获得的多个与陆地棉主要经济性状相关的标记位点中筛选了多个环境下与纤维品质（＞3 个环境）、产量相关农艺性状（＞3个环境）、抗病性（＞2 个环境）关联的26 个SSR 标记[29-31]，在474 份陆地棉材料中验证鉴定效果。 参照陆地棉参考基因组（Gossypium hirsutumv1.1,https://phytozome-next.jgi.doe.gov/info/Ghirsutum_v1_1）[33]进行BLAST （Basic Local Alignment Search Tool）比对，获得SSR 标记最佳比对区间，具体方法参见张素君等[29]。 筛选的标记分布在5 条A 染色体和8 条D 染色体上，染色体覆盖率为50%（表1）。 按照改良的CTAB 法提取基因组DNA[34]， 利用附表2 中的引物进行PCR 扩增，PCR 反应体系及反应程序参见文献[29]，利用8%聚丙烯酰胺凝胶电泳对PCR 产物进行分离后银染[35]，采用0、1 统计方法统计带型。

表1 SSR 标记及其关联性状Table 1 SSR markers and associated traits

1.4 数据统计与分析

利用BLUP （Best linear unbiased prediction）计算获得各表型数据值，利用SPSS 19.0[36]软件描述分析表型性状， 按照0、1 带型进行统计分组，并进行单因素分析和差异显著性分析[37]，对达到显著差异的带型（P＜0.05），参照钱能[38]的方法计算表型效应，具体计算方法为：

ai＝∑xij/ni－∑Nk/nk（3）

式中，ai代表第i个等位变异的表型效应，xij为携带第i个等位变异的第j份材料性状表型测定值，ni为具有第i等位变异的材料数。Nk为所有材料的表型测定值，nk为材料数。若ai为正，则认为该等位变异为增效等位变异，反之为减效等位变异。 根据表型效应大小评价标记筛选效果，并挖掘典型材料。

2 结果与分析

2.1 纤维品质、产量、抗病性相关性状多样性分析

对2019―2020 年474 份陆地棉材料的11个性状进行BLUP 分析后统计（表2），黄萎病抗性变异系数最大 （51.76%）， 其次为单株铃数（26.32%），其他变异系数超过10%的还有单株果枝数（11.75%）和衣分（10.19%）。 5 个纤维品质指标的变异系数平均值为5.86%， 长度整齐度变异系数最小，仅为0.89%，其余4 个纤维品质指标的变异系数在5.53%～9.06%之间。 除长度整齐度之外，11 个性状在多个环境下的平均变异系数均大于5%， 变幅为0.89%～51.76%， 平均值为13.29%。 上述数据表明供试群体在产量、纤维品质和抗病性方面均具有较为丰富的多样性，这为后续验证关联标记的有效性提供了良好的表型数据基础。

表2 陆地棉材料表型数据分析Table 2Statistic analysis of phenotypic data from upland cotton materials

对11 个性状进行相关性分析（表3），在产量相关指标方面：衣分与单株果枝数、单株铃数、铃重呈显著或极显著正相关（P＜0.05 或P＜0.01），铃重与株高、单株果枝数、衣分正相关（P＜0.05或P＜0.01），单株铃数与株高、单株果枝数、衣分呈显著或极显著正相关（P＜0.05 或P＜0.01），单株果枝数与单株铃数、铃重、衣分、株高均呈极显著正相关（P＜0.01），株高与单株果枝数、单株铃数、铃重均呈极显著正相关（P＜0.01）；在纤维品质指标方面，纤维上半部平均长度、断裂比强度、长度整齐度指数三者之间极显著正相关，且均与马克隆值极显著负相关（P＜0.01）；产量性状与纤维品质性状之间， 衣分与纤维上半部平均长度、断裂比强度均呈极显著负相关（P＜0.01），与马克隆值和断裂伸长率呈极显著正相关（P＜0.01）；黄萎病相对病指与株高、单株果枝数、单株铃数、铃重、衣分、马克隆值均呈显著或极显著负相关（P＜0.05 或P＜0.01）。

表3 陆地棉各性状相关系数Table 3Correlation coefficient of traits in cotton

2.2 关联标记多态性信息

利用PowerMarker V 3.25 软件分析标记多态性信息， 在474 份陆地棉中，26 个标记共检测到29 个多态性位点，各位点上等位基因数为2～7 个，平均每个位点3.517 3 个（附表2）。 包含3个及以上等位变异位点的标记17 个， 占比58.62%。 多态性信息含量 （Polymorphism informaxion content,PIC） 平均值为0.343 5， 变幅为0.063 4（BNL2448）～0.684 4（NAU4057）；基因多样性指数平均为0. 406 7， 变异范围为0.065 6（BNL2448）～0.728 5（NAU4057），基因多样性指数和PIC 值均大于平均数占总数的53.30%，上述数据表明本研究选用标记在供试群体中具备较好的多态性， 可进行下一步标记验证工作。

2.3 基于SSR 的遗传多样性分析

采用NTSYS 软件， 在SSR 数据基础上对474 份陆地棉材料进行聚类分组（附表1），在相似系数0.65 处，可将陆地棉划分为3 类，第Ⅰ大类包含437 份材料，占比92.19%，第Ⅱ大类包括36 份材料，占比7.59%，第Ⅲ大类仅有1 份材料，为木胞。 比较聚类分析结果与系谱资料和资源来源，在一定程度上具有可比性，同时存在不同选育单位的资源或品种相似度较高的情况，这可能是由于优质种质在不同育种单位之间流动较大，打破了种质的地域界限。 3 类材料主要性状平均值见表4，Ⅰ类和Ⅱ类材料各性状平均值无明显差异。 Ⅲ类中的木胞是湖北省农业科学院经济作物研究所将木棉与陆地棉进行远缘杂交创制的种质材料，其株高较高，抗病性较好，从分子标记也能看出此材料与其他材料遗传距离较远。

表4 不同聚类分组各性状平均值Table 4Mean values of various traits in different clusters

分析聚类结果， 利用本研究中的26 个标记可将420 份陆地棉完全区分， 其余54 份材料无法完全区分但可区分亲缘关系远近，精准鉴定材料比例达88.61%。 整体上看，选用的标记组合可以用来判定不同材料的亲缘关系远近及品系鉴定。 由于陆地棉遗传背景较为狭窄，加之本次选用的材料数量较多，个别相似度较高的材料无法完全区分。

2.4 标记与关联性状的相关性及表型效应检测

检测发现，26 个SSR 标记共产生了59 个变异位点，共计有14 个SSR 标记的20 个变异位点的关联性状的表型值差异显著（P＜0.05），其中差异达到极显著水平的变异位点有9 个（P＜0.01）（表5）。具体来说，与铃重密切关联的变异位点有6 个，增效位点和减效位点各3 个，增效效果最好的位点为BNL2440-240（名称为标记名- 条带大小，下同），表型效应高达1.27 g（P＝0.01），减效表型效应最大的为BNL226-205（P＝0.02），表型效应为－0.58 g。 将3 个增效位点组合，表型效应为0.27 g（P＝0.00）；与纤维上半部平均长度密切关联的变异位点有6 个，增效位点和减效位点各3 个，增效效果最好的位点为JESPR152-125，表型效应高达0.60 mm（P＝0.00），减效表型效应最大的为CGR6528-185（P＝0.00），表型效应为－0.39 mm。 将3 个增效位点组合，表型效应高达1.27 mm（P＝0.00），此组合标记可用于优质材料筛选；与马克隆值、断裂伸长率、株高和单株铃数关联的位点分别有3、3、1、1 个，变异位点及表型效应参见表5 和图1。 本试验选用的与衣分、纤维断裂比强度和黄萎病相对病情指数关联的标记的所有变异位点与关联性状在474 份陆地棉中均未达到显著差异水平。

图1 不同变异位点对产量、品质相关性状的筛选效果（P＜0.05）Fig. 1 Effects of different mutation sites on yield and quality-related traits (P<0.05)

表5 具有显著（P＜0.05）筛选效果的标记位点信息Table 5Information of markers with significant (P<0.05) selection effect on phenotypic traits

表5（续）Table 5(Continued)

2.5 棉花产量、 纤维品质性状相关联的SSR 标记优异材料挖掘

在产量及纤维品质等方面具有显著筛选效果的20 个变异位点中， 每个位点分别鉴定出了4～5 份典型材料（表5），进一步筛选出聚合了优异等位变异的材料14 份（表6）。 其中，冀棉128和冀棉2016 均同时聚合了3 个纤维上半部平均长 度 增 效 位 点（CM45-140 ＋CGR6528-180 ＋JESPR152-125）；2011NWF 同时聚合了3 个纤维上半部平均长度增效位点（CM45-140＋CGR6528-180＋JESPR152-125）和1 个马克隆值减效位点（DPL0886-158）；JMX-18、ZXJDL F6、12-6034 和冀3927 均同时聚合了3 个铃重增效位点（JESPR220-160＋BNL2440-240＋BNL226-320）；金陆长1 号聚合了2 个纤维长度增效位点（CM45-140＋JESPR152-125）；新陆早66 号和新陆中36 号均同时聚合了3 个纤维长度增效位点（JESPR152-125＋CM45-140＋CGR6528-180）；新陆中7 号、 光子资源、2011NWM 和鲁棉研27同时聚合了2～3 个断裂伸长率增效位点。

表6 典型材料聚合位点及表型性状Table 6Combination of elite alleles and phenotypic traits in typical materials

3 讨论

3.1 供试材料各性状遗传多样性分析

陆地棉遗传多样性的研究对揭示棉花遗传规律、优良基因的挖掘、优异种质有效利用具有重要意义[39-40]。 本文对474 份陆地棉材料的遗传多样性分析显示，11 项性状平均变异系数为13.29%， 说明供试材料具有丰富的遗传多样性。黄萎病相对病情指数变异系数最高， 为51.76%，是单株铃数（第2 位）变异系数的1.97 倍，说明供试材料在黄萎病抗性方面差异明显。 5 项产量性状（株高、单株果枝数、单株铃数、铃重、衣分）的平均变异系数为13.03%，5 项纤维品质性状 （纤维上半部平均长度、断裂比强度、马克隆值、断裂伸长率、 长度整齐度指数） 的平均变异系数为5.86%。 纤维品质性状平均变异系数比产量性状平均变异系数低，这与李慧琴等[41]、尹会会等[42]的研究结果一致，纤维品质与产量性状平均变异系数都不高，可能与陆地棉遗传基础狭窄有关[43-44]。黄萎病相对病情指数变异系数高达51.76%，说明样本间在黄萎病抗性方面差异较大[45]。

3.2 标记位点的筛选效果分析

分子标记不受环境和生育期影响，用于筛选目标材料的效率高[46]，分子标记辅助选择育种大大缩短了育种年限[47]。 然而，直接把定位的QTL用于棉花品种选育或资源筛选的案例却较少，主要由于缺少具有广适性且易于检测的分子标记，因此，获得目标性状相关的QTL 位点后，评估标记的有效性和选择效率，筛选实用性高的分子标记，可推进棉花分子育种进程。

本研究利用关联分析挖掘到的与纤维品质、产量、抗病性相关的SSR 标记，对遗传多样性更为丰富的陆地棉资源进行通用性验证。 本研究选用的26 个关联标记共检测到59 个变异位点，其中20 个变异位点筛选效果显著， 比对已发表文献，标记CGR6528、NAU2697 和BNL1694 在不同群体中均检测到了与纤维品质性状关联的位点[38,46]，在本研究中，CGR6528 的2 个变异位点均与纤维长度显著关联， 具有显著的筛选作用，而NAU2697 和BNL1694 并未检测到具有显著筛选效果的位点， 可能连锁的非主效QTL 受到环境及群体影响，不能稳定发挥作用。 从标记的筛选效率看， 尽管关联群体和验证群体差异较大， 但在本群体中选用的26 个标记的有效率可达33.90%，且筛选效果明显的位点多集中在多环境下均显著关联的位点。 在具有显著筛选效果的位点中， 纤维上半部平均长度的位点组合（CM45-140、CG R6528-180 和JESPR152-125 表型效应为1.27 mm，比单位点筛选效果都高，相关性水平为极显著， 可用于优质材料的筛选工作；与铃重显著相关的位点BNL2440-240 表型效应高达1.27 g，增效效果最好，但大部分材料能扩增出目的条带，可用于过滤一些小铃材料，而将JESPR220-160、BNL2440-240 和BNL226-320 位点组合后，虽然表型效应降低，但其筛选大铃的效果更好，可靠性更高，该组合可以用于大铃材料筛选。 研究表明，关联位点组合在一起，筛选效果更好，这与水稻[47]、木瓜[48]以及芒果[49]中的研究结果一致。

同时，本研究选用的衣分、断裂比强度和黄萎病相对病情指数关联的标记所有变异位点与关联性状均未达到显著差异水平， 可能原因如下：首先，表型性状是受基因和环境共同影响的，表型数据的准确性也会对标记有效性的评估结果产生影响，例如，环境对黄萎病抗性影响较大，在挖掘和验证关联位点时，可考虑从增加鉴定环境， 严格规范标准等方面提高表型数据的准确性；其次，作物大多数农艺性状（如产量、品质、抗病性等）是受主效基因和微效基因共同控制的数量性状[51]，如果鉴定到与主效QTL 紧密连锁的分子标记，则具有较好的筛选效果，如果筛选到与性状有关的微效位点， 通用性则会大大降低；再次，分子标记筛选效果与性状的遗传机理、供试群体数量以及遗传背景等因素有关[47]。 分析鉴定铃重的标记组合（JESPR220-160、BNL2440-240 和BNL226-320）和品质筛选组合（CM45-140、CGR6528-180 和JESPR152-125）对其他性状的影响发现，前者对单株果枝数和衣分也有正向筛选效应（0.01＜P＜0.05），其相应单株铃数、衣分、纤维品质指标的表型值差异不显著。 品质筛选组合同时对纤维上半部平均长度（正向），断裂比强度（正向）和马克隆值（负向）起到极显著筛选作用（P＜0.01），推测可能是该标记组合对应的染色体片段包含纤维发育相关的基因。 但是，该组合在本研究群体中对衣分也起到了显著负向筛选作用，对株高、铃重、单株铃数、单株果枝数等性状影响不显著。 如何获得与品质相关的、同时又不影响产量性状的位点值得深思。 总体来说，本研究获得的筛选位点和组合为棉花分子标记利用提供了有益的参考。

3.3 优异典型材料的分子标记聚合

利用分子标记挖掘优异资源对棉花育种具有重要作用。 Ma 等[51]通过重测序，收集了迄今为止最庞大的棉花性状相关位点数据库，为棉花种质资源创新和分子育种提供了数据支撑。 Wang等[5]通过全基因组关联分析在基因组水平上鉴定产量和纤维品质相关的标记位点， 鉴定出14 份携带优异基因的种质资源，可用于同步改良陆地棉产量和纤维品质。 本研究利用20 个在产量及纤维品质等方面具有显著筛选效果的变异位点，筛选出14 份优异典型材料，经过表型鉴定，14 份材料均在目标性状上表现突出，该研究提高了种质资源筛选效率。 在以后棉花育种工作中，应将分子标记辅助选择技术和常规育种技术进行有效集成，围绕提高育种效率建立优质、高产、多抗的多性状同步改良技术平台[52]，对提高棉花新品种选育效率具有重要意义。

4 结论

本研究获得了与铃重密切关联的标记位点组合（JESPR220-160、BNL2440-240 和BNL226-320） 和与纤维上半部平均长度密切关联的标记位点组合（CM45-140、CGR6528-180 和JESPR152-125），分别可用于大铃和长纤维材料的筛选。 同时，筛选出14 份典型材料，经过田间表型鉴定，均在目标性状上表现突出。 本研究将为分子标记辅助育种提供重要信息。

附表：

详见本刊网站（http://journal.cricaas.com.cn/）本文网页版。

附表1 474 份陆地棉材料

Table S1 474 upland cotton materials

附表2 SSR 标记信息

Table S2 Information of SSR markers