QuEChERS结合UPLC-MS/MS法测定畜肉中8种抗真菌药物残留

黄永桥，宋光林，毛敏霞，杨昌彪，马 凯，高 亮,*

（1.贵州省检测技术研究应用中心，贵州 贵阳 550016；2.贵州省分析测试研究院，贵州 贵阳 550016）

畜牧业的发展与各种药物密切相关，这些药物被广泛用于预防或控制疾病，以增加肉类产量，降低成本。抗真菌药物是重要的一类药物，常用于治疗由烟曲霉、白色念珠菌和新生隐球菌等真菌引起的各种疾病。抗真菌药物根据其化学结构可分为棘白菌素类、多烯类、嘧啶类、丙烯胺类及烯丙基胺衍生物等。

研究表明，抗真菌药物并不完全安全，如唑类抗真菌药物具有一定的肝毒性，并对肾上腺和性腺有一定的抑制作用；灰黄霉素具有一定的神经毒性、肝毒性、致癌性及致畸作用等。因此，新抗真菌药物的研究与开发主要考虑对现有药物的毒性降低、提高药效为目的的剂型改良和结果修饰。由于滥用药物或没有严格遵守药物安全间隔期导致药物或其代谢物残留，会对人体健康产生影响，增加消费者的潜在风险。因此，加强畜产品中该类药物残留量的检测必不可少，建立畜产品中抗真菌药物残留量的检测方法具有重要意义。

目前，有关抗真菌药物测定的方法主要有高效液相色谱法、液相色谱-串联质谱法。液相色谱法灵敏度较低、选择性较差；超高效液相色谱-串联质谱（ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）法因具有较高的灵敏度、选择性和抗干扰能力，被广泛用于痕量化合物分析方法中。张凯等采用QuEChERS dSPE EMR-Lipid净化管的前处理方法，建立了测定羊肉中8种抗真菌药物的UPLC-MS/MS快速检测方法；邵明媛和蔡永通等采用乙二胺--丙基硅烷（primary secondary amine，PSA）吸附剂的前处理方法，建立了测定化妆品中抗真菌药物的UPLC-MS/MS快速检测方法。然而应用QuEChERS结合UPLC-MS/MS法针对多种畜肉（猪肉、牛肉、羊肉）中抗真菌药物残留的检测技术罕见报道，且缺乏相关检测标准，已发布的标准及法规对抗真菌药物在畜肉中的最大残留限量也未作规定。因此，建立高通量超痕量的快速检测技术，对畜肉中抗真菌药物残留的检测方法技术进行研究显得非常必要。QuEChERS法作为新开发的一种快速、简便、低成本且环境友好的前处理方法，被广泛用于农兽药残留测定、非法添加药物测定及污染物测定等方面。

本研究以猪肉、牛肉和羊肉为研究对象，采用QuEChERS法进行前处理，结合UPLC-MS/MS仪，对样品前处理条件和仪器条件进行优化，建立QuEChERS结合UPLC-MS/MS的分析方法，并对建立的方法进行方法学评价。该方法可用于畜肉中8种抗真菌药物残留量的快速定性和定量分析，为食品安全监管提供强有力的技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

猪肉、牛肉和羊肉 贵州贵阳各大型超市及农贸市场；甲醇、乙腈（均为色谱纯） 德国Merck公司；乙腈、乙酸乙酯、无水硫酸钠（均为分析纯） 天津市科密欧化学试剂有限公司；甲酸（色谱纯）、十八烷基键合硅胶C吸附剂（40～63 μm）、PSA吸附剂（40～63 μm） 上海安普实验科技股份有限公司；QuEChERS dSPE EMR-Lipid净化管 美国Agilent公司；Oasis PRiME HLB固相萃取小柱 美国Waters公司；陶瓷均质子 北京迪马科技有限公司；8种抗真菌药物混合标准溶液（纯度＞98%，100 μg/mL灰黄霉素、克霉唑、咪康唑、益康唑、联苯苄唑、酮康唑、氟康唑、萘替芬） 天津阿尔塔科技有限公司；0.22 μm PTFE滤膜上海安普实验科技股份有限公司。

1.2 仪器与设备

6470三重四极杆串联质谱仪（配有电喷雾离子源）、1290 UPLC仪 美国Agilent公司；Blixer3搅拌机法国Robot Coupa公司；LT2002电子天平 常熟市天量仪器有限公司；UMV-2多管涡旋混合器 北京普立泰科仪器有限公司；L-550离心机 湖南湘仪离心机仪器有限公司；Milli-Q超纯水机 美国Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 标准溶液配制

从100 μg/mL 8种抗真菌药物混合标准溶液中准确移取1.00 mL于10 mL棕色容量瓶中，用乙腈溶解并定容刻度，混匀，配制成质量浓度为10.0 μg/mL标准储备液，-18 ℃避光保存。移取100.0 μL标准储备液于10 mL棕色容量瓶中，用乙腈定容，配制成100 ng/mL的标准溶液。移取1.0 mL 100 ng/mL的标准溶液于10 mL棕色容量瓶中，用乙腈定容，配制成10 ng/mL的标准工作液，备用。

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1.3.2 样品前处理

称取捣碎后的组织样品5.00 g于50 mL具塞离心管中，准确加入10 mL 0.1%甲酸-乙腈，加入1 粒陶瓷均质子，涡旋振荡10 min，4 500 r/min常温离心10 min，吸取2 mL上清液于预先加有500 mg无水硫酸钠和25 mg C吸附剂的离心管中，涡旋1 min，5 000 r/min离心2 min，取上清液过0.22 µm PTFE滤膜，待测。

1.3.3 仪器条件

1.3.3.1 色谱条件

色谱柱：ZORBAX Eclipse Plus-C反相色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流动相：A为0.1%甲酸溶液，B为乙腈；流速：0.3 mL/min；柱温：40 ℃；进样量：5.0 μL；梯度洗脱程序：0～0.5 min，90% A、10% B；0.5～0.6 min，90%～54% A、10%～46% B；0.6～4.5 min，54%～48% A、46%～52% B；4.5～4.6 min，48%～10% A、52%～90% B；4.6～5.5 min，10% A、90% B；5.5～5.51 min，10%～90% A、90%～10% B；5.51～7 min，90% A、10% B。

1.3.3.2 质谱条件

离子源：电喷雾离子源，正离子扫描模式；多反应监测；毛细管电压：4.0 kV；雾化器压力：40 psi；干燥气流速：10 L/min；干燥气温度：300 ℃；鞘气流速：10 L/min；鞘气温度：300 ℃。

1.4 数据统计及图表绘制

所有数据均在Agilent MassHunter Data Acquisition软件下采集，采用Qualitative Analysis Navigator B.08.00定性软件、Quantitative Analysis B.09.00定量软件进行数据处理；图表绘制采用Excel 2016和Origin 2018版。

2 结果与分析

2.1 样品前处理的优化

2.1.1 提取

乙腈和乙酸乙酯作为常用提取溶剂，对多数化合物有较好的提取效率，降低提取溶剂的pH值能破坏样品的组织结构，使目标物从组织中游离出来，加快提取效率。本实验比较乙腈、0.1%甲酸-乙腈、乙酸乙酯和0.1%甲酸-乙酸乙酯作为提取溶剂时对8种抗真菌药物的提取效率，结果见图1。乙酸乙酯和0.1%甲酸-乙酸乙酯对酮康唑回收率为0%，对氟康唑、联苯苄唑、灰黄霉素和咪康唑的提取效率均不理想（回收率均＜45%），对萘替芬和克霉唑的提取效率较差（回收率＜55%），益康唑的提取效率满足要求（回收率＞75%）。乙腈和0.1%甲酸-乙腈对8种抗真菌药物的提取效果较好（回收率均＞70%），且0.1%甲酸-乙腈的提取效果略优于乙腈，因此，选择0.1%甲酸-乙腈作为样品提取溶剂。

涡旋振荡提取能使溶剂与样品基质充分混合，实验考察涡旋振荡提取时间（5、10、15 min）对提取效率的影响。结果发现，在5～10 min时，随着时间的延长提取效果明显增大，10 min以后随着时间的延长，提取效果基本趋于稳定，故选用涡旋振荡10 min作为样品提取时间。

图1 提取溶剂对8种抗真菌药物回收率的影响（n=3）Fig. 1 Effects of different extraction solvents on the recovery of eight antifungal drugs (n = 3)

2.1.2 净化

畜肉中含有较多的脂肪、色素和磷脂等杂质，净化时需尽可能多的去除杂质干扰，又要减少对目标物的损失。QuEChERS法处理快速简单，常用的吸附剂有C、PSA、GCB等。PSA可吸附金属离子、色素、脂肪酸和其他极性有机酸等杂质，C可以吸附脂肪等弱极性杂质。本研究对QuEChERS dSPE EMR-Lipid净化管、Oasis PRiME HLB固相萃取小柱（无须活化、淋洗及洗脱等步骤，可快速吸附杂质）、PSA及C吸附剂进行了考察（图2A）。结果表明，使用Oasis PRiME HLB固相萃取小柱时，除氟康唑（11%）和益康唑（56%）有较小回收率外，对其他目标物吸附性很强；使用PSA吸附剂时，除氟康唑（59%）、酮康唑（63%）和咪康唑（68%）回收率较差，其他目标化合物回收率均大于74%；QuEChERS dSPE EMR-Lipid净化管及C吸附剂对目标物均有较好的回收率，C吸附剂的回收率、杂质干扰及基线噪声等均优于QuEChERS dSPE EMR-Lipid净化管。因此，选取C吸附剂进行净化。

研究进一步对C吸附剂用量（25、50、100 mg）进行考察。如图2B所示，除益康唑的回收率随C吸附剂的用量增加而增大外，其余指标的回收率均随C吸附剂的用量增加而变小，故选用25 mg C吸附剂净化样品。QuEChERS净化方法通常加入一定量的吸水剂，促进目标化合物由水相分配至有机相。此研究对无水硫酸钠的用量一并进行了研究，最终确定无水硫酸钠的使用量为500 mg。综合考虑，使用500 mg无水硫酸钠和25 mg C吸附剂作为样品净化方法。

图2 不同净化方法（A）和C18吸附剂用量（B）对回收率的影响（n=3）Fig. 2 Effects of different purification methods (A) and the amount of C18 adsorbent (B) on the recovery of eight antifungal drugs (n = 3)

2.2 色谱条件的优化

8种抗真菌药物化学结构差异大，化学性质不同，本实验采用UPLC，选择ZORBAX Eclipse Plus-C色谱柱对目标物进行分离。流动相中加入甲酸可以增加色谱柱的保留能力，提高分离效果。分别考察50 mm和100 mm的色谱柱，以及乙腈、甲醇、0.1%甲酸溶液、0.1%甲酸溶液含2 mmol/L乙酸铵溶液等不同洗脱体系的分离能力。结果表明，使用100 mm的色谱柱各化合物分离度更好；使用乙腈-0.1%甲酸溶液作为流动相时，目标物有良好的色谱分离效果，有较好的响应值。进一步对梯度洗脱程序进行优化，使目标物有较好的分离度，缩短样品分析时间，提高了分析效率。最终确立了使用ZORBAX Eclipse Plus-C（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）色谱柱，采用梯度洗脱，样品单次分析时间为7 min，满足批量样品的快速检测分析。

2.3 质谱条件的优化结果

参考文献[15-16]方法，配制100 μg/L的混合标准溶液，在正离子模式下进行一级全扫描质谱得到准分子离子（[M+H]），通过调试选择最佳锥孔电压和毛细管电压，然后将准分子离子进行二级质谱分析，得到子离子特征碎片，选择特征碎片中离子中响应值高、基线噪声低的两对离子对作为定性离子和定量离子，优化子离子对碰撞能量，使其丰度最大；进一步优化雾化器压力、干燥和鞘气的温度及压力等质谱参数，使其离子化效率最佳，得到最优的质谱条件，结果见表1。

表1 8种抗真菌药物检测质谱参数Table 1 Mass spectrometric parameters for eight antifungal drugs

2.4 方法学评价

2.4.1 基质效应（matrix effect，ME）的评价

ME是指试样中基质成分会抑制或增强目标化合物的离子化，当ME过大时会降低方法的选择性和灵敏度，影响分析结果的准确性，因而在建立分析方法时需对ME进行评价，并采取适当措施消除或减弱其对结果准确性的影响。采用1.3.1节基质匹配和纯溶剂标准曲线，并采用计算公式：ME/%=[（基质匹配标准曲线斜率/纯溶剂标准曲线斜率）-1]×100。通常，当|ME|≤10%时，ME可忽略不计；当|ME|在10%～20%之间时，存在较弱的ME；当|ME|＞20%时，存在强ME。表2表明，8种抗真菌药物在3种畜肉基质中均存在强基质抑制效应，为校正ME对结果的影响，在定量分析中使用基质匹配标准曲线。本实验的ME评价结果与张凯等结果具有一致性。

2.4.2 方法的标准曲线和检出限实验结果

采用空白基质样液配制系列混合标准工作溶液（0.05～10.00 μg/L），在选定的色谱和质谱条件下测定，以峰面积（）对其质量浓度（）绘制校准曲线。如表2所示，8种抗真菌药物在各自线性范围内，线性关系良好，相关系数（）均大于0.998。通过向阴性样品中添加目标物的标准溶液，以3 倍信噪比（=3）计算检出限，以=10计算定量限。最终确定方法的检出限为0.1 μg/kg，定量限为0.3 μg/kg。

表2 8种抗真菌药物的线性方程、相关系数（r）、检出限、定量限及METable 2 Linear equations, correlation coefficients (r), limits of detection,limits of quantification and matrix effects for eight antifungal drugs

续表2

2.4.3 加标回收及精密度考察结果

采用基质加标法对加标回收和精密度进行考察，在猪肉、牛肉和羊肉阴性样品中分别添加低、中、高3个加标水平，每个添加水平重复6 次，连续做3 d，按照1.3.2节样品前处理方法处理后上机测定，分别计算加标回收率、准确度和精密度（用变异系数（coefficient of variation，CV）表示）。由表3可知，8种抗真菌药物的准确度均在15%以内，日内平均回收率为85.7%～113.6%，日内CV为1.2%～14.8%；日间平均回收率为87.6%～107.9%，日间CV为2.1%～14.6%。本方法具有良好的回收率和精密度。标准溶液、空白样品及加标样品MRM色谱图见图3。

表3 8种抗真菌药物的平均回收率和精密度Table 3 Average recoveries and precision for eight antifungal drugs in meat

续表3

图3 标准溶液、样品空白及样品加标MRM色谱图Fig. 3 MRM chromatograms of standard solution, blank samples and samples spiked with eight antifungal drugs

2.5 样品检测结果

按本研究建立的方法对市售的猪肉40 批次、牛肉30 批次、羊肉10 批次进行测定。结果显示，猪肉中有1 批次检出益康唑含量为3.96 μg/kg；牛肉中有1 批次检出酮康唑含量为0.37 μg/kg，1 批次检出灰黄霉素含量为0.75 μg/kg，3 批次检出益康唑含量分别为0.47、0.33、0.34 μg/kg；其余样品及指标均未超检出限。本方法可用于畜肉中8种抗真菌药物残留的检测。

3 结 论

建立QuEChERS结合UPLC-MS/MS法快速测定畜肉中8种抗真菌药物残留量检测方法。样品用0.1%甲酸-乙腈提取，经QuEChERS吸附剂净化去除干扰物质，简化前处理步骤，并有效提高了净化效率。应用本方法可在7 min内完成畜肉中8种抗真菌药物残留分析，且目标物有较好的分离度，相关系数（）均大于0.998，检出限为0.1 μg/kg，定量限为0.3 μg/kg，8种抗真菌药物在3种畜肉基质中的准确度在15%以内，日内平均回收率为85.7%～113.6%，日内CV为1.2%～14.8%；日间平均回收率为87.6%～107.9%，日间CV为2.1%～14.6%。该方法检出限和定量限低，加标回收率和精密度良好，且前处理简单、快速、灵敏度高、重复性好和分析准确，能够准确定性和定量分析畜肉中8种抗真菌药物残留量，为日常分析检测提供了技术支持。