数字化高温大曲发酵过程中微生物群落结构的变化

郑亚伦，赵 婷，王家胜，蔡开云，陈 萍，邓俊松，方尚玲,3，曹敬华,3，陈茂彬,3,*

（1.湖北工业大学生物工程与食品学院，湖北 武汉 430070；2.湖北稻花香酒业股份有限公司，湖北 宜昌 443000；3.湖北省酿造工艺与装备工程技术中心，湖北 武汉 430070）

白酒在中国传统文化中有着重要的地位。大曲是白酒酿造的发酵启动剂，其质量对白酒的品质有极大影响，大曲风味物质决定了白酒的香气。按照大曲的生产温度可划分为不同类别，不同温度的大曲有不同的微生物群落结构。高温大曲的生产最高温度可达到65 ℃，较高温度可以抑制酵母和霉菌的生长，形成以嗜热菌为主要优势微生物的群落结构。大曲中酶类丰富，包括糖化酶、液化酶、蛋白酶等。大曲提供的酶类物质能够分解白酒的发酵原料，为后续的微生物发酵提供营养。并且大曲作为白酒发酵的原料之一，能够为发酵产物提供丰富的风味物质和风味前体物质。研究大曲中微生物的群落结构，了解微生物的多样性和功能对白酒的生产有十分重要的意义。长期以来，研究人员利用可培养的方式培养从大曲中分离出了包括嗜热芽孢杆菌、球菌以及放线菌等微生物，但该方法无法全面检测大曲中的微生物群落。以Illumina MiSeq测序平台为代表的第二代测序技术具有快速、客观、准确的优点被应用于大曲微生物结构的分析，相关研究人员应用该技术分析了不同储存时间、不同类型以及不同颜色大曲的微生物群落结构。

现阶段，白酒企业大多采取由人工测量记录和控制发酵条件的传统制曲方式，其存在工人经验误差大、大曲质量不稳定等弊端。为减少生产季节和生产经验带来的大曲质量的差异，白酒生产企业更倾向于探究新的大曲发酵方式。本研究将温度、湿度、二氧化碳等传感器布置在大曲发酵间的四周，电脑实时记录发酵数据。根据企业的生产数据由电脑计算出最佳发酵参数，当高温大曲的发酵条件和设定值不同时，由电脑控制系统对发酵间的温度、湿度等进行调节（图1）。将数字化管理系统用于大曲的生产过程，便于监控发酵环境的各项数据，实现大曲发酵的数字化管理。已有很多的学者研究过大曲中微生物群落结构，也明确了大曲中优势微生物组成。但对数字化管理系统在大曲发酵过程中的应用还没有系统性的研究。

本实验收集了由数字化管理系统生产的高温大曲和传统方式生产的高温大曲各4个时间点的3个平行样本，利用高通量测序揭示数字化高温大曲（digital high-temperature，IHD）和传统高温大曲（traditional high-temperature，THD）在发酵过程中微生物多样性的变化趋势以及差异。旨在验证数字化管理系统在大曲生产中运用的可行性，有助于推动大曲的自动化生产。

图1 数字化管理系统在高温大曲发酵过程中的应用Fig. 1 Application of digital management system in the fermentation process of high-temperature Daqu

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

IHD在发酵阶段由系统管理发酵，其他生产工艺与传统发酵相同，选择0、18、30、60 d取样。IHD编号为：IHD0、IHD18、IHD30、IHD60；THD样本编号为：THD0、THD18、THD30、THD60。实验所用样本均来自湖北省宜昌市某白酒生产企业。从发酵房间的4个角落以及中间取出5 份样本，在无菌研磨机粉碎混合均匀后，取400 g用于分析理化数据，同时取适量的样本于样本管中，-20 ℃保存。

E.Z.N.A.Soil DNA Kit DNA抽提试剂盒 美国Omega BioTek公司；琼脂糖 西班牙Biowest公司；FastPolymerase 中国TransGen公司；MiSeq Reagent Kit v3测序试剂盒 美国Illumina公司。

1.2 仪器与设备

5430 R小型离心机 德国Eppendorf公司；NanoDrop2000超微量分光光度计 美国Thermo Fisher Scientific公司；ELx800酶标仪 美国BioTek公司；GeneAmp 9700型聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）仪 美国ABI公司；MiSeq测序仪美国Illumina公司。

1.3 方法

1.3.1 大曲理化特性分析

水分、pH值、淀粉、发酵力和酯化力根据QB/T 4257—2011《酿酒大曲通用分析方法》进行测定，还原糖含量采用3,5-二硝基水杨酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）法测定。同时分析了糖化酶活力、液化酶活力。大曲所有的理化性质都以干质量计算。

1.3.2 DNA提取扩增及高通量测序

使用E.Z.N.A.Soil DNA Kit提取试剂盒提取0.5 g大曲样本中的总DNA，DNA的完整性由1%琼脂糖凝胶电泳检验。为了鉴定细菌，使用通用引物341F/806R扩增16S rRNA的V3-V4高变区，为了鉴定样本中的真菌，使用引物ITS1F/ITS2R进行PCR扩增。使用NEXTFLEX Rapid DNA-Seq Kit进行建库，PCR产物纯化用于测序。最后文库利用Illumina公司的MiSeq PE300平台测序，由上海美吉生物医药科技有限公司完成。

1.3.3 微生物多样性分析

利用QIIME（v 1.17）平台对序列进行物种分析和多样性评价。使用FASTP软件对原始序列进行质控，使用FLASH软件进行拼接。使用UPARSE软件，以97%的相似性对非重复序列进行可操作分类单元（operational taxonomic units，OTU）聚类，得到OTU代表序列。将具有代表性的序列与RDP、SLIVA和Greengenes数据库进行对比。利用Mothur软件进行多样性指数计算，包括Chao 1指数、ACE指数、Shannon指数和Simpson指数。基于UniFrac方法进行多样性分析，通过R软件实现。

1.4 统计学分析

2 结果与分析

2.1 理化特性分析

如图2所示，两种高温大曲水分变化规律无明显差异，都呈现下降的趋势，在发酵的前30 d下降较快，后期较缓慢。IHD的水分从39.70%下降至11.04%，THD的水分从39.42%降至12.10%。还原糖和pH值都呈现先上升后下降的趋势，而淀粉含量则始终呈现下降的趋势。IHD和THD的淀粉质量分数都在发酵结束时最低，分别为52.36%和54.48%，两者的淀粉消耗率在18%左右。两种高温大曲的酯化力和液化酶活力随发酵的进行逐步上升，在发酵终点达到峰值。发酵力在发酵的第0、18天时稍低，随之呈现上升后下降的趋势，在第30天最高。第30天时IHD的发酵力高于THD，发酵结束时两者的发酵力基本相同。两种高温大曲的糖化酶活力在发酵开始时最高，在第18天最低，随后出现缓步上升。

图2 高温大曲发酵过程中理化性质及酶活力的变化Fig. 2 Changes in physicochemical properties and enzyme activity during the fermentation of high-temperature Daqu

2.2 α多样性分析

测序结果表明，24个高温大曲样本中共检测出25 门、56 纲、147 目、279 科、619 属、967种。相比而言，真菌的微生物丰富度远低于细菌，从全部的样本中检测出真菌7 门、24 纲、60 目、129 科、229 属、365种。测序的覆盖率高于99%且稀释曲线接近平缓，说明测序深度足够且能反映样本中微生物的实际情况。用Chao 1指数、Sobs指数和Simpson指数评价微生物群落的丰富度和多样性，见表1。

前些天，笔者回农村老家，和妻子孩子陪着母亲在场镇上逛了一圈，发现在挤满场镇街道两边的货摊上和商店里摆放的好些货品卖相不佳，特别是一些家庭生活必需品的质量堪忧，有些货品看起来已经非常老旧了，但仍旧摆放在摊位上和店里售卖，生意也自然冷冷清清，少有人驻足和问津。

表1 高温大曲发酵过程α多样性指数Table 1 α-Diversity indexes of bacterial and fungal communities in the fermentation process of high-temperature Daqu

两种高温大曲细菌群落的Simpson指数均呈先减少后上升的趋势，发酵结束时低于发酵初始。这说明细菌群落的多样性增加，在第18天时最高。细菌群落的Chao 1指数与Simpson指数变化规律相反，Chao 1指数先上升后下降。IHD60的Chao 1指数高于THD60，这说明发酵结束时IHD的细菌丰富度高于THD。Simpson指数下降说明群体的多样性上升，反之，则多样性下降。如表1所示，真菌群落的Simpson指数比发酵初始时高，说明两种高温大曲的真菌群落多样性随发酵时间的延长而下降。两种高温大曲的细菌和真菌多样性变化情况基本相似，但IHD整体的丰富度和多样性多数高于THD。

图3 微生物群落α多样性指数的差异显著性分析Fig. 3 Significant difference analysis of α-diversity indexes of microbial communities

如图3所示，两个相同发酵时间的样本之间的值小于0.05时具有显著差异。细菌群落在发酵过程中，IHD和THD在相同时间时Sobs指数无显著差异（＞0.05）。对于真菌群落，发酵IHD60和THD60的真菌丰富度具有显著差异（=0.01），其余IHD和THD在相同时间点的样本丰富度无显著差异。IHD60与THD60的Sobs指数间有显著差异，说明两者实际观察到的OTU数目差异大。但是结合Chao1算法估计的OTU数目和多样性指数（表1）综合分析，两种高温大曲在发酵完成时微生物群落之间有较好的相似性。

2.3 大曲微生物群落结构

所有高温大曲样本中的细菌隶属于25 门，其中相对含量高于1%的有5 门，包括厚壁菌门（Firmicutes）、放线菌门（Actinobacteria）、变形菌门（Proteobacteria）、蓝细菌门（Cyanobacteria）和拟杆菌门（Bacteroidota）。随着发酵的进行，18、30、60 d的IHD样本形成以Firmicutes为绝对优势门的微生物群落结构，其相对丰度都高于80%。THD中微生物门的变化趋势与IHD相似，第18、30、60天的THD样本中Firmicutes相对丰度比同时间的IHD低20%左右（图4a）。THD第18、30、60天的样本形成以Firmicutes和Actinobacteria为绝对优势门的微生物群落结构。

图4 发酵过程中的细菌群落在门水平（a）和属水平（b）的相对丰度Fig. 4 Relative abundance of bacterial community during the fermentation process at the phylum level (a) and the genus level (b)

如图4b所示，IHD18和THD18在属组成具有十分显著的差异，这与多样性指数的差异显著性分析相吻合（图2b）。IHD18中优势菌属为乳酸杆菌属（，38.31%）、狭义梭菌属（，12.46%）、链球菌属（，10.95%）、布劳特氏菌属（，6.33%）等。THD18中，糖多孢菌属（，33.77%）、高温放线菌属（，17.88%）、芽孢杆菌属（，33.15%）和在属水平未分类的伪诺卡式菌科（f_Pseudonocardiaceae，11.52%）为优势菌。第30天的样本中微生物菌属没有明显区别，但IHD30中相对丰度＞1%的菌属较THD30多。IHD30和THD30两者的菌属丰度具有较大的区别，包括克罗彭斯特菌属（，IHD 7.73%，THD 27.48%）、（IHD 6.88%，THD 25.34%）、（IHD 50.45%，THD 23.64%）和f_Pseudonocardiaceae（IHD 2.14%，THD 8.06%）。发酵第60天时，IHD和THD都形成以、和葡萄球菌属（）为主的微生物群落结构。

图5 发酵过程中的真菌群落在门水平（a）和属水平（b）的相对丰度Fig. 5 Relative abundance of fungal community during the fermentation process at the phylum level (a) and the genus level (b)

真菌有3个门的相对丰度＞1%（图5a），子囊菌门（Ascomycota）是绝对的优势菌门，其相对丰度在整个发酵过程中都高于90%。如图5b所示，真菌属在不同的发酵时间也具有明显区别。第0天的高温大曲中微生物群落的多样性最高，这与Simpson指数分析结果相同（表1）。IHD0和THD0微生物在属水平组成相似，都检测出嗜热子囊菌属（，IHD 22.23%，THD 26.78%）、嗜热真菌属（，IHD 3.88%，THD 8.49%）、曲霉菌属（，IHD 40.06%，THD 11.21%）、链格孢菌属（，IHD 15.28%，THD 24.15%）和耐干霉菌属（，IHD 6.06%，THD 9.88%）等，除此之外第0天的高温大曲中还有较多相对丰度大于1%的菌属。IHD18的菌属相对丰度较为均匀，而THD18中相对丰度达到95.36%。第30、60天的样本则是形成以和为优势菌属的真菌群落结构。

2.4 β多样性分析

基于Bray-Curtis距离算法对所有的高温大曲样本进行NMDS分析，结果如图6所示。对细菌群落测序结果进行排序分析，其stress值为0.066＜0.1，排序结果良好。从图6a可知，发酵第0天的样本具有较好的相似性，IHD0和THD0空间分布靠近。IHD18独自分布在第2象限，与其他样本的距离较远，这表明IHD18样本的微生物组成与其他样本具有显著差异。真菌群落的NMDS分析结果如图6b所示，其stress值为0.068＜0.1。相似性分析进一步计算了群落的离散情况（=0.002）。IHD60和THD60组间微生物组成相似，组内微生物组成也具有较高的相似性。其余样本组内离散程度高，IHD和THD相同发酵时间的高温大曲差异性显著。基于微生物数据对其进行层级聚类分析，结果表明层级聚类分析结果与NMDS分析结果相似。

图6 微生物群落的NMDS和层级聚类树分析Fig. 6 NMDS and hierarchical clustering analysis of microbial communities

2.5 理化性质与微生物相关性分析

表2 发酵过程中优势属与理化性质的相关性Table 2 Correlation between dominant genus and physicochemical properties during fermentation process

3 讨 论

高温大曲在成型阶段会加入一定比例的母曲，为大曲接入部分微生物和生物酶，这部分微生物和酶将成为高温大曲发酵的启动助力。高温大曲能够在自然发酵过程中富集对发酵有利的微生物，而这些微生物的主要来源于母曲、原料、空气和制曲的工具。随着发酵的进行，大曲中微生物群落的组成结构在不断变化，微生物群体出现更迭，利用高通量测序技术研究高温大曲在发酵过程中微生物群落组成的变化。测序结果表明，两种高温大曲细菌群落的优势菌属为、、、、和。优势真菌属为、和等。相关文献报道中，大曲的主要优势微生物菌属为、、乳酸球菌属（）、、假丝酵母属（）和。大曲主要优势微生物与本研究高温大曲检测出的微生物有所重合，但在不同的文献中微生物群落具有一定的差异。这可能是因为大曲生产的地理环境因素和生产原料的不同所导致，不同类型的大曲和各异的发酵环境使大曲形成不同的微生物群落结构。

高温大曲在发酵过程中微生物群落组成变化显著，但IHD和THD在发酵完成时，都形成了以、、和为主要菌属的细菌群落结构。这些菌属在大曲微生物群落结构的研究报道中接连出现，酱香风味的大曲中、为核心物种。其他报道中也都是优势菌属，其具有强大的水解能力且与大曲中吡嗪类物质的生成呈现显著正相关，对白酒风味物质的生成具有重要的作用。已知能够产生多种水解酶，包括蛋白酶和糖化酶，这些酶类物质有助于白酒发酵原料的糖化液化。和在酱香和浓香型的大曲中含量丰富，这些菌属在大曲发酵前期都有报道。其中在谷物当中普遍存在，高温大曲中的可能来源于原料和母曲，能将葡萄糖转化为乳酸，为酵母形成乳酸乙酯提供底物，而乳酸乙酯是白酒中重要的风味成分之一。Tao Yong等发现乳酸是影响微生物群落结构的主要因素，乳酸含量过多时会抑制其他微生物的生长。白酒发酵过程中微生物群落结构的变化，如含量的变化会引起乙酸、乳酸和乙酸乙酯的增加，乳酸乙酯的水平下降，大曲微生物群落的变化对白酒发酵也会有重要的影响。和也在其他的文献中报道过。和是小麦中最丰富的菌属，其中能够产生耐热的-淀粉酶，帮助淀粉水解为葡萄糖、麦芽糖等。

两种高温大曲在发酵结束时均形成以、、为主要真菌属的群落结构。发酵第0天的高温大曲真菌群落多样性比发酵结束时高，且在第0天的高温大曲中链格孢属（）的相对丰度较高，但在后续的样本中未检测出。在空气中大量存在，能够在粮食中快速生长，但其并不利于大曲的发酵和白酒的酿造。微生物群落结构随发酵时间的推移发生显著变化，在后期的发酵样本中消亡，这与其他报道的观点相吻合：大曲发酵是自然选择有利微生物的过程。一般来讲大多数的酵母菌在50 ℃以上时几乎不生长，而高温大曲的最高生产温度能达到65 ℃，因此真菌群落中丰度占据绝对优势的是、等耐热性的真菌。

两种大曲在发酵过程中水分和淀粉含量稳步下降，在发酵结束时达到最低。按一般生产经验，大曲淀粉含量在50%、水分含量在10%～14%时较好。发酵力大小与细菌和耐热性真菌显著正相关，高温大曲在开放式的发酵环境中不断富集来源不同的微生物，淘汰不耐热的微生物并且驯化耐高温菌形成以耐热菌为优势菌属的群落结构。高温大曲的最高温度会上升至65 ℃，高温几乎淘汰掉了所有酵母和大多数霉菌，因此高温大曲亦能称为细菌曲。

大曲微生物群落的更替与环境因子有关，Tang Hanlan等认为环境变量是促进大曲发酵过程中微生物变化的驱动力。结果表明水分对细菌和真菌群落影响较大，与Guan Tongwei等的研究结果相似。除水分外，温度对大曲微生物结构的影响也很重要，相关研究表明温度对大曲微生物的多样性和丰度有极大影响，且细菌群落比真菌更容易受水分的影响。大曲温度呈现先升高后保持相对的稳定后又下降，这可能是由于微生物在合适的生长条件下迅速繁殖，微生物生长繁殖产生的大量生物热使发酵温度迅速升高，高温使酵母和不耐热的霉菌迅速被淘汰。大曲在后熟生香期水分降低，其水分活度不再适合微生物进行大量的生长繁殖因而大曲的温度开始下降，降至室温时发酵结束。通过相关性计算可知微生物与环境因子之间的关系，但其内在的相互作用机制还有待进一步研究。

发酵时间相同时，两种大曲的微生物群落组成和丰度具有略微差异，这可能是由于发酵环境的湿度和温度的差异导致。THD的发酵温度靠生物热和生产季节的环境温度共同决定，排潮和降湿都由人工完成，高温大曲的品质受季节的影响较大。综合比较IHD和THD的微生物组成和理化性质可知，两者在发酵时间相同时，微生物多样性和理化性质之间并没有显著差异，NMDS分析和层级聚类分析可以证明这一观点。数字化发酵根据设定值和外界环境参数对大曲发酵进行调节，能够更好地重现生产参数。同时实时的数据监控系统可以帮助记录大曲的发酵情况，能够降低人工生产带来的品质波动，降低人工参与度。

4 结 论

高温大曲的主要细菌类群为、、和，主要的真菌类群为、、。IHD和THD在相发酵时间时的微生物群落具有良好相关性，两者在发酵结束时并无显著差异。IHD的酯化力、糖化酶活力和液化酶活力略高于THD，其他理化特性无明显的差异。数字化管理系统在大曲生产中的应用具有可行性，为大曲的数字化生产提供一定的理论支撑。在此研究基础上可以进一步研究改进大曲的数字化生产工艺，推动大曲自动化生产。