基于高通量技术对比分析南洲大曲与茅台大曲的细菌多样性

何猛超，罗家顺，罗 轲，3，涂翠娥，张娇娇，胡景辉，韩兴林

（1.中国食品发酵工业研究院有限公司，北京 100015；2.湖南南洲酒业有限公司，湖南南县 413200；3.湖南中和生物科技有限公司，湖南益阳 413000；4.国家酒类品质与安全国际联合研究中心，北京 100015）

酱香型白酒作为中国传统白酒之一，以酱香突出、浓郁丰满、空杯留香持久的特点受到广大消费者的青睐。酱香型白酒以高粱为原料，高温大曲为糖化发酵剂经高温堆积、高温发酵、高温馏酒、三年陈酿等工艺酿造。高温大曲又称“细菌曲”，作为酱香型白酒特有的曲种，含有多种微生物以及丰富的酶系，是酱香型白酒发酵过程中微生物的主要来源，同时赋予酱香型白酒独特的香气和风味。酒曲质量的好坏很大程度上影响白酒的品质，由于不同地区、不同白酒企业使用的高温大曲不同，导致生产的酱香型白酒品质各异。因此，研究高温大曲的微生物群落结构，尤其是细菌群落结构，有利于调控酱香型高温大曲的制曲工艺，对酱香型白酒的优质酿造具有深远意义。

随着现代技术的高速发展，高通量测序技术在白酒行业的运用十分广泛，主要用于研究酒曲、酿造环境、酒醅等微生物多样性。近年来，高通量技术在酱香型白酒行业的研究中逐渐普遍，利用高通量技术解析高温大曲的微生物群落结构及功能，结合传统可培养方式筛选、分离功能微生物，两种技术的联用能更好地解析高温大曲的微生物多样性，对深入研究高温大曲中不同微生物的产酶、产香特性具有重要意义。

茅台酒是我国酱香型白酒的典型代表，其使用的高温大曲也是酱香型白酒行业公认的优质大曲。以茅台大曲为对照，研究其他酱香型白酒企业的高温大曲微生物群落结构，对比分析两者的微生物差异性，将有助于企业调控制曲工艺，提升产品的品质。湖南南洲酒业有限公司，具有百年酿酒历史，致力于以稻米、高粱、小麦为主要原料的湖南区域特色的酒类产品开发和产业化生产研究，酿造的酱香型白酒选用贵州茅台地区生产的红缨子糯高粱，采用“三高三长”酱酒酿制工艺，所酿酒体酱香突出，幽雅细腻，深受业界及消费者好评。目前，鲜有关于我公司南洲大曲的研究报道。

基于此，本研究运用高通量测序技术检测南洲大曲和茅台大曲的细菌多样性，采用生物信息学分析方法对比研究南洲大曲与茅台大曲之间的细菌群落结构差异。通过本研究为我公司酱香型大曲工艺的改良以及产品质量的提高提供指导。

1 材料与方法

1.1 材料、仪器

耗材：本实验所用高温大曲为南洲大曲以及茅台大曲，由湖南南洲酒业有限公司提供。大曲微生物DNA试剂盒为Fast DNA®Spin Kit for Soil。

仪器：Illumina MiSeq 高通量测序平台，美国Illumina公司。

1.2 试验方法

1.2.1 大曲微生物DNA的提取

采用Fast DNA® Spin Kit for Soil 试剂盒提取两种大曲的总DNA，具体提取步骤参照试剂盒说明书。提取后的DNA 采用Nanodrop 进行定量，并通过1.2 %琼脂糖凝胶电泳检测DNA 提取质量。检测合格的样品使用TruSeq® DNA PCR-Free Sample Preparation Kit 建库试剂盒进行文库构建。细菌使用引物515F（5'-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3'）和806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）扩增V4 高变区。本测试在中国食品发酵工业研究院高通量测序平台完成。

1.2.2 生物信息学分析

在序列充足的情况下，为了使分析结果质量更高，首先对测序得到的原始数据（Raw Data）进行过滤处理，得到有效数据（Clean Data），基于有效数据进 行OTUs（Operational Taxonomic Units）聚 类分析。基于OTU 聚类结果，可对OTU 进行Alpha 多样性分析，了解样品内微生物群落的多样性和丰富度。基于物种组成分析，得到相应的物种信息；Venn图分析得到样品间共有或独有的物种数目。

2 结果与分析

2.1 两种高温大曲细菌群落Alpha 多样性比较分析

通过质量初筛的原始数据进行质控、去噪、拼接、去嵌合体后的样品的高质量序列量分别为茅台大曲68679、南洲大曲67202。基于细菌OTU 数进行Alpha 多样性指数分析以及丰度等级曲线分析如表1、图1 所示。从表1 可以看出，两个高温大曲样品的覆盖率（Goods coverage）均高于0.99，说明测序结果具有较高可信度，能够反映样品的真实情况。

图1 丰度等级曲线图

一般，多样性指数主要反映样品内微生物群落的多样性和丰富度。其中，Chao1 指数和Observed species 指数标示样品细菌群落的丰富度，Chao1 指数和Observed species 指数越大，表明群落的丰富度越高。茅台大曲的Chao1 指数和Ob-served species 指数分别为432.61、428.80，均高于南洲大曲（Chao1 指数421.28，Observed species 指数420.60），说明茅台大曲样品的细菌群落丰富度高（表1）。Simpson 指数、Shannon 指数用来反映样品的物种多样性，Shannon 指数/Simpson 指数值越高，表明群落的多样性越高。就样品的细菌多样性来说，南洲大曲样品的Simpson 指数（0.96）以及Shannon 指数（5.93）较高，表明南洲大曲样品中细菌多样性高。Pielou’s evenness 指数标示微生物群落的均匀性，南洲大曲样品的细菌群落均匀性略高于茅台大曲。

表1 两种高温大曲细菌群落Alpha多样性指数比较分析结果

图1 为两个样品的丰度等级曲线图，该曲线可以直观地反映群落中高丰度和稀有OTU 的数量。折线在横轴上的长度反映了样品在该丰度中的OTU 数；折线的平缓程度，反映了群落组成的均匀度，折线越平缓，则群落中各OTU 间的丰度差异越小，群落组成的均匀度越高，折线越陡峭，则均匀度越低。从图1 可知，两个高温大曲样品微生物群落组成均匀。

2.2 两种大曲之间物种差异性分析

韦恩图可以直观反映不同样品之间的共有物种和特有物种，茅台大曲和南洲大曲两个样品的微生物物种差异性如图2 所示。从图2 可知，茅台大曲和南洲大曲的细菌数分别为430、419，两个高温大曲之间共有的细菌数仅为86 个，说明两者之间的细菌群落差异性较大，这可能与两种大曲制曲的环境、气候不同相关。

图2 两种高温大曲的韦恩图

2.3 两种大曲之间细菌群落结构比较分析

2.3.1 两种大曲的细菌门水平群落结构分析

为进一步比较两种大曲之间细菌群落丰度上的差异，根据OTU 分析结果，对样品数据在门和属水平上进行分类学分析。选取在门水平上丰度排名前20 的微生物进行差异性分析，结果见图3。从图3 可知，茅台大曲和南洲大曲中的优势菌门均为Firmicutes（厚壁菌门）、Proteobacteria（变形菌门）、Actinobacteria（放线菌门）、Bacteroidetes（拟杆菌门）以及Cyanobacteria（蓝藻菌门）。这与前人研究结果相似，赵驰等发现不同原料制成的高温大曲均是以厚壁菌门和放线菌门为绝对优势门；侯强川等发现湖北省尧治河高温大曲以厚壁菌门、放线菌门、变形菌门作为优势菌门；戴奕杰等发现酱香型白酒在高温制曲、发酵酿酒两个阶段的优势菌门均为厚壁菌门、放线菌门、变形菌门、拟杆菌门4类。说明酱香型白酒的优势菌门以上述4 类为主，但不同菌门的丰度不一致。本研究中南洲大曲和茅台大曲就4 类优势菌门而言，细菌的群落丰度存在差异。南洲大曲的放线菌门（8.36 %）丰度显著低于茅台大曲的放线菌门丰度（23.62 %），变形菌门丰度（30.66%）显著高于茅台大曲的变形菌门丰度（14.22%）。

图3 基于门水平两种高温大曲的细菌相对丰度图

2.3.2 两种大曲的细菌属水平群落结构分析

基于属水平两种大曲的细菌相对丰度图如图4所示。相对丰度较高的菌属为（芽孢杆菌属）、（乳球菌属）、（糖多孢菌属）、（克罗彭斯特菌属）、（假诺卡氏菌属）、（片球菌属）、（魏斯氏菌属）、（高温放线菌属）等。本文研究与前人研究结果相似，GAN等分析茅台大曲的微生物群落组成和功能特征，发现优势菌群为链孢杆菌属（）、芽孢杆菌属（）、乳酸菌属（）、糖多孢菌属（）和枝芽孢菌属（）等；JIANG 等采用高通量测序技术解析北方酱香型白酒高温大曲制曲过程中微生物多样性，结果表明，6 个大曲样品中主要细菌属为乳酸菌（）、魏斯氏菌（）、芽孢杆菌（）、糖多孢菌（）等。从图4 来看，（芽孢杆菌属）在南洲大曲和茅台大曲中是绝对优势菌属，相对丰度分别为24.03%、22.96%。研究表明，芽孢杆菌属是酱香型白酒中的功能微生物，具有较强的酶分泌能力，能产生蛋白酶、纤维素酶、糖化酶等，还能生成酱香型白酒中的风味成分，如四甲基吡嗪等。在茅台酒曲中为优势菌属的（乳球菌属）19.13 %、（克罗彭斯特菌属）7.00 %，在南洲大曲中的相对丰度仅为2.15 %和1.57 %。相反地，南洲大曲中相对丰度较高的（片球菌属）9.18%、（魏斯氏菌属）8.26%、（沙雷氏菌属）4.54 %、（高温放线菌属）4.54 %等几个菌属在茅台大曲中相对丰度较低，仅为0.85 %、0.20 %、0.27 %、0.15 %。上述结果显示两种大曲之间在细菌属水平上存在较大差异，南洲大曲存在独特的微生物群落结构。有报道显示，克罗彭斯特菌属在白酒发酵中有利于乙酸、乳酸、乙酸乙酯等风味的形成。魏斯氏菌属作为乳酸菌的一类，具有生成乳酸，降低发酵体系pH 值的作用，在传统发酵食品行业是至关重要的菌株。因此，通过对比茅台大曲和南洲大曲细菌属的差异，可为后续南洲大曲酒厂筛选功能微生物或强化大曲提供一定指导。

图4 基于属水平两种高温大曲的细菌相对丰度图

3 结论

本研究采取高通量测序技术，以茅台大曲为标尺对比分析了南洲大曲的细菌群落结构和多样性。结果表明，Alpha多样性指数中，茅台大曲的细菌群落丰富度较高，南洲大曲的细菌群落多样性较高。在细菌门水平，茅台大曲和南洲大曲中的优势菌门均为Firmicutes（厚壁菌门）、Proteobacteria（变形菌门）、Actinobacteria（放线菌门）、Bacteroidetes（拟杆菌门）以及Cyanobacteria（蓝藻菌门）。南洲大曲的放线菌门（8.36 %）丰度显著低于茅台大曲的放线菌门丰度（23.62 %），变形菌门丰度（30.66 %）显著高于茅台大曲的变形菌门丰度（14.22%）；细菌属水平，南洲大曲和茅台大曲的绝对优势菌属均为（芽孢杆菌属），但两种大曲之间在细菌属水平上存在较大差异，南洲大曲存在独特的微生物群落结构，其优势菌属为（芽孢杆菌属）、（片球菌属）、（魏斯氏菌属）、（沙雷氏菌属）等。通过对比分析南洲大曲与茅台大曲之间的细菌群落结构和多样性差异，可为后续酱香型大曲工艺的改良以及产品质量的提高提供有益指导。