MSI检测在胃癌治疗中的研究进展

胃癌是最常见的消化系统恶性肿瘤之一，是世界上排名第五的癌症和第三大癌症死亡原因，给患者及家庭带来沉重的负担

。由于胃癌无特异性症状，大多数患者就诊时已处于晚期。近些年来，基础科学和临床研究的进步清楚地表明，胃癌的诊断不再仅仅依靠组织学诊断，分子技术水平的提高使越来越多的患者受益于分子诊断

。2020版CSCO胃癌诊疗指南已将胃癌组织中评估微卫星不稳定(microsatellite instability, MSI/错配修复缺陷(deficient mismatch repair, dMMR)状态“Ⅱ级推荐(ⅠB类证据)”改为“Ⅰ级推荐(ⅠB类证据)”，同时高度微卫星不稳定(microsatellite instability-high, MSI-H)/dMMR是晚期胃癌免疫检查点抑制剂有效治疗的预测标志物，对晚期胃癌患者的治疗和预后具有指导作用

。

从浙江经验走向全国，“最多跑一次”改革书写了深化放管服改革的新篇章，迈入“互联网+政务服务”发展的新阶段。

1 微卫星(microsatellites，MS)概述

MS，又称为简单重复序列，是具有1～10个核苷酸重复序列的DNA链，在人类基因中分布广泛。这些重复序列非常不稳定，比基因组中的其他序列突变频率更高，其突变率每代10

～10

不等

。错配修复(mismatch repair，MMR)系统是一种DNA完整性维护系统，MMR基因的体细胞或胚系表观/遗传改变会导致DNA MMR功能丧失，引起基因组中大量突变的积累，从而产生一种被称为MSI的分子表型。因为通过免疫组织化学(immunohistochemistry, IHC)识别的dMMR状态和通过PCR识别的MSI-H状态通常90%以上是一致的，所以术语dMMR与MSI-H可互换使用

。MMR系统由至少7种蛋白质组成，分别是h-MLH1、h-MLH3、h-MSH2、h-MSH3、h-MSH6、h-PMS1和h-PMS2，它们与特定的伙伴结合形成功能性异源二聚体，识别DNA复制过程中发生的碱基对错配和小核苷酸插入/缺失(1～4个碱基对)

。这些蛋白与肿瘤的发生关系密切，研究

表明，hMLH1基因启动子的过甲基化和hMSH2基因编码区的突变与胃癌的发生相关。hMSH6突变在子宫内膜癌的发生中起重要作用，与结直肠癌有很大不同的是，子宫内膜癌患者中hMSH6的突变较hMLH1和hMSH2的突变更常见

。MLH3基因位于14号染色体q24.3位点，在PubMed数据库发现，在人类MLH3中有15个SNP被引用，其中SNP rs1650697与散发性大肠癌和MSI显著相关。rs175080对肝细胞癌、肺癌和宫颈癌有不良影响，与胃癌的关系尚未见报道

。MLH3基因是否有望成为MSI检测的新的生物标志物，值得深入研究。组蛋白H3赖氨酸36位三甲基化(H3K36me3)是一个重要的组蛋白标志，参与转录延伸和DNA MMR。研究

表明，在正常情况下，依赖于H3K36me3的MMR优先保护活跃转录的抑癌基因，以避免发生突变。组蛋白H3K36me3可通过与MSH6直接作用招募hMutSα，进而调控MMR功能，当细胞缺少H3K36me3等调控MMR功能的蛋白时表现为MSI-H。这对后续的研究有所启发，可以通过全基因组测序分析H3K36me3并发现其富集区域，识别MSI-H的患者并提早进行干预，以达到较好的治疗效果。如果仅仅依靠H3K36me3来确定MSI-H，似乎并不全面，是否可以与其他生物标志物共同确定MSI-H，还需要大量相关实验来证明。

2 MSI检测方法

目前MSI的检测方法主要有IHC、PCR、二代测序(next generation sequencing，NGS)，最近，通过循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA，CtDNA)识别MSI的方法也在进行中。不同类型的标本和变异需要选择不同的检测方法，检测位点的选择是MSI诊断中极为重要的因素，影响MSI诊断的准确性和灵敏度等。IHC分析MMR蛋白表达是检测MSI/MMR系统状态的常用方法，这种方法对MMR基因产物丢失(MLH1、MSH2、MSH6和PMS2)进行分析可以指导特定基因胚系突变的DNA测序以诊断Lynch综合征。标准化MMR判读与病理报告可根据不同医院的病理报告格式不同而不同。若4个蛋白中任意一个或多个阴性(细胞核不着色)时，则病理报告为dMMR，相当于MSI-H；若4个蛋白均表达正常，则判读为错配修复表达完整(proficient mismatch repair，pMMR)，相当于MSI-L或微卫星稳定(microsatellite stability，MSS)

。PCR法是MSI检测的另一种方法，旨在比较来自同一个体的正常组织和肿瘤之间的一组MS标记，以识别MSI-H的肿瘤。这种分析方法可以在新鲜的、冰冻的或石蜡包埋的肿瘤组织上进行

。美国国家癌症研究院公布了肿瘤中检测MSI的5个位点，其中至少2个位点发生改变时称MSI-H，仅有1个位点改变时称MSI-L，未出现位点改变时称MSS

。基于PCR的MSI检测与IHC检测MMR蛋白高度一致，灵敏度>90%，特异度很高

。近年来，NGS技术逐渐发展和成熟，不同NGS平台的肿瘤基因组测序被证明能够准确地检测MSI状态，与基于PCR的MSI测试的符合率达到95%

。NGS法与传统检测技术相比更具优势，为实现单瘤种的所有基因变异及泛瘤种的热点基因变异进行同时检测成为可能

。但是，由于成本和周转时间的限制，使得基于NGS的MSI检测方法未能在临床实践中常规使用。

3 MSI在胃癌中的表达

2021年NCCN指南推荐所有新确诊的胃癌患者常规完成MSI检测

。研究表明，有15%～30%的胃癌病例中会发生MSI，MSI胃癌可以发生在遗传综合征的背景下，如Lynch综合征，但大多数是零星发生的，只有10%表现出家族聚集性

。Latham等

采用靶向NGS方法确定MSI状态，根据MSI状态来确定Lynch综合征在实体肿瘤中的患病率，同时还可忽略肿瘤类型、家族遗传史等因素，来评估MSI-H/MMR-D患者Lynch综合征的胚系基因。目前尽管对患MSI-H胃癌的相关危险因素有较多的研究证实，但其在全球的发病率差异仍然较大。有研究

认为，这可能是由于MSI与地域因素有关，最终导致不同地域可能呈现出不同的组织学特征。

MSI与结肠癌患者的生存率提高有关，并可能预示在Ⅱ期疾病中缺乏辅助化疗的益处。因此，建议对切除的结直肠癌患者通过ICH或MSI来评估dMMR，以指导治疗决定和筛查Lynch综合征

。结直肠癌中，更近端、低分化和黏液性以及淋巴结转移较少的肿瘤，预后较好。然而，胃癌患者的生存期与MSI之间的关系尚未确定。一荟萃研究认为，MSI-H型较MSS型胃癌患者的总生存期更长，有着更佳的预后

。但存在异质性，造成这种异质性的潜在原因可能是流行病学的改变或化疗的效果

。Yang等

在来自癌症基因组图谱和亚洲队列GSE62254的样本中定义了胃腺癌亚型，将MSI-H STAD样本基本上分为两个亚组(MSI-H1和MSI-H2)。进一步的免疫图谱检查显示，MSI-H1亚组预后比MSI-H2亚组差，可能与抑制性免疫受体和趋化因子的富集有关。在MSI-H2亚群中，氧化磷酸化(oxidative phosphorylation, OXPHOS)、过氧化物酶体等代谢途径被增强，OXPHOS上调，可能使其对OXPHOS敏感，靶向OXPHOS的抑制剂有可能成为一种有前途的抗癌疗法。

MSI亚型胃癌是帕博丽珠单抗用药指征。MSI型胃癌中，错配修复基因的突变导致了肿瘤组织总体突变负荷高，且常常伴随着有丝分裂通路的激活。研究

显示，MSI型胃癌具有较高水平的淋巴细胞浸润，提示MSI型胃癌相对良好的预后可能与机体免疫相关。另一方面，研究证实PD-1/PD-L1及CTLA-4等免疫检查点抑制剂在高突变负荷的肿瘤如恶性黑色素瘤、非小细胞肺癌中更容易取得好的疗效，而低频至中频突变负荷的肿瘤往往对其不敏感

。目前，由肿瘤基因突变产生的新抗原已被证实是成功免疫治疗的主要作用靶点，与良好的临床免疫治疗疗效密切相关

。MSI型胃癌因其高突变负荷、高新抗原频率的特征，有望成为包括免疫检查点在内的临床免疫治疗潜在的获益群体

。与之相对应的是，早在被FDA批准应用于胃癌之前，免疫检查点抑制剂PD-1单抗已于同年5月被批准用于多种实体瘤MSI亚型的治疗

。

4 MSI与胃癌TCGA和ACRG分型

考虑试件加载经历的4个受力阶段，将节点骨架曲线简化为考虑刚度退化的四段折线模型。骨架曲线各特征点分别为开裂点A(Pc, Δc)；屈服荷载点B(Py, Δy)；峰值荷载点C(Pmax,Δmax)；极限荷载点D(Pu, Δu)。其中屈服荷载点B采用“通用屈服弯矩法”求得，极限荷载点D取峰值荷载的85%。由于各试件骨架曲线存在一定差异性，首先对各试件骨架曲线进行无量纲化处理，如图7所示，+Pmax和+Δmax分别表示节点正向加载的峰值荷载及其对应的位移，-Pmax和-Δmax分别表示节点负向加载的峰值荷载及其对应的位移。

目前，已发现丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)和磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)通路的成员在胃癌发生发展过程中发生突变和激活，与TCGA中对于MSI-H胃癌突变分析的研究

一致。近来发现，12例胃癌中有3例出现了编码PI3K的p110α催化亚基的PIK3CA基因突变，其中有80%聚集在涉及螺旋和激酶结构域的两个区域内。对其中一个“热点”突变体的体外研究表明，它是一种激活突变

。有一项研究通过直接测序的方法在94例胃癌患者中筛查PIK3CA突变情况，其中80%的已知PIK3CA突变发生在基因区域。结果发现4例(4.3%)PIK3CA突变，在这4例中，3例肿瘤表现为MSI，2例肿瘤同时存在KRAS突变。从而得出结论：胃癌中PI3K信号通路的激活可能是通过PIK3CA的上调或突变实现的，后者可能是dMMR的结果

。为了更好地了解分子胃癌实体可能有助于该肿瘤的个体化治疗，一项实验对胃癌患者PIK3CA突变的临床和病理资料进行了比较，结果发现大多数PIK3CA突变患者存在MSI(

<0.001)。携带PIK3CA突变的和未突变的MS感染患者的5年生存率分别为40%和70.4%(

=0.309)。外显子9突变患者的5年生存率为0，外显子20突变患者的5年生存率为80%(

=0.031)。由此得出，胃癌中PIK3CA突变与MSI分子亚群密切相关，比其他MSI患者预后更差。外显子9的突变与外显子20的突变相比，导致了更差的预后

。PD-1/PD-L1抗体与其他免疫检查点靶向药物的联合化疗正在开发中，作为一种潜在的治疗策略，可以获得显著的疗效。然而，根据TCGA研究，更有前景的联合靶向药物可能是PI3K抑制剂，而不是免疫检查点靶向药物或抗血管生成药物

。

企业重组业务作为一项不同于日常经营活动的非常规业务，对提升企业影响力和竞争力具有重要意义。重组业务的复杂性也对企业全体人员提出了更高的要求。企业重组业务会给企业的税务管理工作带来一定风险，因此企业应该加强税收筹划，降低税务风险，促进重组业务有计划有效率地进行。

2014年，TCGA提出了一个涵盖4种胃癌基因亚型的分子分类：EB病毒(Epstein-Barr virus，EBV)阳性、MSI、基因组稳定(genome stability，GS)和染色体不稳定性(chromosome instability, CIN)

。不同的亚型因特定的分子发病特征而显著，例如，EBV阳性肿瘤具有复发性、PIK3CA突变及涉及JAK2、PD-L1和PD-L2的扩增。EBV通过刺激多种宿主蛋白和途径，促进细胞凋亡和调节细胞增殖。EBV胃癌具有如下特征：(1)肿瘤组织PD-L1高表达，EBV胃癌往往伴有免疫相关基因的扩增，其中编码PD-L1、PD-L2的基因均有明显扩增；(2)局部高水平淋巴细胞浸润，EBV胃癌伴有明显的细胞趋化因子水平的改变，能更多地吸引T淋巴细胞浸润至肿瘤局部；(3)高频基因突变，EBV胃癌具有以PIK3CA(10%～80%)、ARID1A(47%～55%)及AKT2(38%)为主的特征性高频基因突变

。肿瘤组织的高PD-L1表达、高水平淋巴细胞浸润及高突变负荷均为免疫检查点阻断治疗获益的生物标志，提示EBV胃癌有望成为胃癌中免疫检查点阻断治疗的优势人群

。TCGA研究证实了启动子甲基化与EBV相关胃癌之间的关系，也证实了EBV与PI3K/Akt和JAK2等信号通路的另一个关键关联。

2015年ACRG发起了一项共纳入300例患者的胃癌分子分型研究，将胃癌分为4种亚型：(1)MSI型：多为Lauren肠型，临床上多分期较早(Ⅰ或Ⅱ期)，预后最佳；(2)MSS/EMT型：较其他亚型发病年龄显著偏低，细胞黏附基因CDH1表达缺失，多对应Lauren弥漫型，且分期较晚(Ⅲ或Ⅳ期)，4种亚型中预后最差；(3)MSS/TP53+型；(4)MSS/TP53-型。MSS/TP53+型和MSS/TP53-型均好发于男性，多对应Lauren 肠型，预后介于MSI型和MSS/EMT型之间，但MSS/TP53+型较其他亚型EBV阳性率明显偏高

。ACRG分型主要基于亚洲人群，主要来自日本和韩国。然而，目前尚不清楚ACRG分类标准是否适用于中国人群

。而且，根据国内外学者的研究，我们发现，与ACRG分型相比，TCGA分型的适用性更强。未来还会出现新的关于胃癌分子分型方面的研究，值得期待。

5 MSI在胃癌免疫治疗中的进展

近些年来，免疫疗法在提高某些实体肿瘤(如黑色素瘤和肺癌)的治疗反应方面显示出了不错的疗效。在大多肿瘤中，较高的突变负荷作为免疫治疗反应的生物标志物。突变水平较高的癌细胞产生更多的肽类抗原，并在其主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex，MHC)I类分子上表达，这使得它们更容易被T细胞识别并被破坏，这为临床医师提供了治疗的新思路，其中最主要的是PD-1/PD-L1阻断治疗。许多研究已经证明，抑制PD-1/PD-L1通路提供了一种非常有效的肿瘤治疗方法，Ⅰ～Ⅲ期试验显示了抗PD-1、抗CTLA-4和联合治疗的良好疗效

。然而，与化疗相比，Pembrolizumab和Avelumab最近在进展期胃癌预处理患者的Ⅲ期试验中均未能延长生存期

。这些有争议的结果强调，并不是所有的进展期胃癌患者均可能从免疫疗法中受益，需要仔细识别和选择患者。在不同的临床组中，各亚型的存活率存在差异。EBV相关性和弥漫性/混合性病例对化疗的反应较好

，而MSI对于免疫治疗显示出了很好的疗效。Pembrolizumab被批准用于治疗MSI-H dMMR实体肿瘤，这是FDA首次批准基于该标志物而不是癌症起源位置的药物用于癌症治疗，这也揭示了癌症免疫治疗的广泛适用性

。双特异性抗体是免疫治疗中的一个新概念，其中一种抗体被设计为具有两个不同靶点的结合位点。癌胚抗原T细胞双特异性抗体(carcinoembryonic antigen T cell bispecific antibody，CEA-TCB)是一种双特异性抗体，可以同时结合癌细胞上表达的CEA和T细胞上的CD3，导致T细胞与癌细胞的结合，而不依赖于其他免疫系统相关的相互作用。CEA-TCB已在实体瘤和MSS的大肠癌中显示出一定疗效

。

6 讨论

晚期胃癌治疗尤其困难，且目前仍以一线化疗为主，二线三线才考虑免疫治疗。晚期胃癌免疫治疗进展后的治疗选择，探索仍在进行中，进展后跨线、再挑战或可有临床获益，将是晚期胃癌免疫治疗未来的探索方向。近年来从分子水平重新认识疾病、应用分子分型指导治疗和预测疗效的相关研究是热点，对新的分子分型检测生物标志物显得尤为重要，但其卫生经济学效益尚不明确。我们需要大量实验研究明确其经济和临床效果，为晚期胃癌患者诊治的临床决策提供理论支撑。下一步治疗晚期胃癌的免疫和靶向治疗的临床试验应该根据基因组差异和免疫学特征进行调整，并为这些亚群发现新的生物学预测标志物，现有的生物标志物与新的生物标志物的组合是未来研究工作的重点。必须继续确定更有效的生物标志物，以在治疗前预测治疗的有效性。期待未来更多的大型临床试验研究，以更多地了解新的生物标志物和靶向疗法，针对个别患者确定较好的治疗策略。

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