一种雄烯二酮衍生物的合成及应用研究

查 娟，潘晓军，李恩民，陈 龙，章潮军，陈春峰，商甜波，罗艳娟，徐慧婷

(1.浙江医药股份有限公司，浙江 绍兴 312000；2.脂溶性维生素浙江省工程研究中心，浙江 绍兴 312000；3.绍兴文理学院 化学化工学院，浙江 绍兴 312000)

乳腺癌（HBDC）是发生在乳腺上皮组织的一种恶性肿瘤[1-2]，乳腺上皮细胞发生癌变导致细胞增殖失控，主要发生在为40～60 岁的绝经妇女群体中。据2012 年全球肿瘤流行病统计数据(GLOBOCAN)显示，全球每年新增病例约167 万例，有超过52.5 万人死于乳腺癌。乳腺癌已成为危害人类健康的一种严重疾病。由于乳腺癌细胞不再具有正常细胞的特征，细胞之间连接疏松，易脱落为游离细胞，可以通过血液或淋巴扩散到全身，从而严重危及生命。我国乳腺癌的发病率逐年上升，北京、上海等大都市发病率达56/10万，已经成为妇女发病率第一的恶性肿瘤[3]，严重影响了患者的生活质量。

乳腺癌对患者体内雌激素存在依懒性，主要原因在于雌激素能够刺激乳腺细胞快速增殖。细胞不断分裂产生新细胞，分裂增殖过程的核心是脱氧核糖核酸（DNA）的复制，DNA 复制过程会产生单链DNA，相比拥有稳定碱基对的双链DNA，单链DNA 更易发生损伤[4]。目前临床上主要有三种治疗乳腺癌的手段：卵巢剥除、抗雌激素药物及芳香酶抑制剂[5-7]。其中芳香酶抑制剂有特异选择性强、耐受性强、毒副作用较小等优点，是目前应用最广的治疗手段。芳香酶抑制剂[8-11]作为新一代药物，其作用机制为：作用于人体雌激素合成路线上的限速酶——芳香化酶(AR,CYP19)，通过占据雌激素合成过程中芳香化酶的位点，打断其合成以降低雌激素的生成水平，持续性地降低人体内的雌激素水平。主要代表药物为依西美坦、来曲唑及阿拉曲唑，其中依西美坦具有可口服、高特异性、无明显交叉耐药反应等优点，因此临床应用广，是研究的热点[12]。依西美坦属于甾体类芳香酶抑制剂（AIs），AIs 高度的专一性和持久的作用性引起人们的注意，科研人员一直在探索合成新型的甾体化合物，为新型抗乳腺癌药物的开发做前期工作。

最初的甾体药物都是天然存在的化合物，一般从动物腺体中分离提取得到，由于甾体药物在临床上表现优良，治疗效果好，科学家开始针对其结构进行研究并探索人工合成这类化合物的方法[13]，自甾体药物开发以来，其发展迅速已成为第二大生产药物，仅次于抗生素，产品种类超过400 种。从结构上看，甾体化合物属于多环化合物，拥有四环结构，由3 个六元环和1 个五元环构成，且一般在C-10、C-13 上有两个角甲基，结构上可以修饰的地方较多。近年来，多项研究发现：以甾体化合物为母核，对其进行支链或者杂原子修饰得到的部分衍生物具有类似甚至超越母核的药理活性[14-20]，在抗癌药开发方面有重大应用前景，因此该领域的研究吸引了越来越多人的注意。

本文提供一种雄烯二酮衍生物—6,16-二亚甲基雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮（I）的制备方法，具体路线见图1。本研究以依西美坦（Ⅱ）和多聚甲醛为原料，二甲胺盐酸盐为催化剂，乙醇为溶剂，采用一锅法经Mannich 反应直接合成目标产物6,16-二亚甲基雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮（I）。通过气相色谱-质谱法（GC-MS）、核磁共振波谱法（1H NMR、13C NMR）等表征并确认其结构。同时，对该化合物的体外抗肿瘤活性进行实验，选用细胞株分别为胃癌细胞株（MKN45）、肺癌细胞（HCC-78）、人乳腺癌细胞（MDA-MB-231）、肝癌细胞（HepG2）以及卵巢癌细胞（3AO）。

图1 6,16-二亚甲基雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮（I）的合成路线

1 仪器与试剂

核磁共振仪：Bruker AVANCE DMX ⅡⅠ400M；高效液相色谱仪：Agilent Technologies 1200 Series；气质联用仪：Agilent Technologies MS5973NGC6890N；酶联免疫检测仪HBS-1096A。

试剂均为市售分析纯。

2 实验部分

2.1 6,16-二亚甲基雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮（I）的制备

向150 mL 的三口反应瓶中依次加入依西美坦（14.80 g，0.050 mol）、多聚甲醛（1.65 g，0.055 mol）、二甲胺盐酸盐（0.40 g，0.005 mol）和乙醇（65 mL），搅拌溶解后，升温至回流并继续搅拌反应，薄层色谱跟踪反应[展开剂体积比为V（乙酸乙酯）:V（石油醚）=1:3]，3 h 后反应结束。减压蒸馏回收溶剂，得到棕色粗品，湿法过柱精制得到目标化合物（I），为淡黄色固体，称重为13.20 g，液相含量为98.6%，熔点为150 ℃～151 ℃，收率为86.3%。

其中，湿法过柱步骤为：先向玻璃层析柱中加入一小团棉花堵住出口，装柱；向层析柱中缓缓倒入硅胶直至2/3 处，用洗耳球敲平整，然后倒入配好的洗脱剂[V（乙酸乙酯）：V（石油醚）=1:6]，并通过加压装置加快洗脱剂的流出，直至柱子中的硅胶无气泡或空隙，呈紧实状，再倒入洗脱剂至液面处于硅胶平面上方1～2 cm 时，关闭活塞，停止加压，准备加样。将减压旋蒸得到的产品溶解于少许二氯甲烷中，用长吸管吸取少量产物缓慢沿壁加样，烧瓶中的产物加完后，将烧瓶润洗再加样，重复直至烧瓶中基本没有反应液，加样完成。先用吸管缓慢滴加洗脱剂，到安全高度后可以直接倒入，将产物冲洗下来。用小试管接洗脱液，过程中通过TLC 检测跟踪过柱过程，将含有目标化合物的洗脱液合并收集，减压旋干得到目标化合物。

产物结构验证：MS：308，293，281，265，207，160，148（100%），128，105，91，77。

1HNMR (δ,ppm,400 MHz,CDCl3)：7.096 (d,J=10.4 Hz,1H,);6.274 (d,J=10.4 Hz,1H,CH=);6.190 (s,1H,CH=);6.117 (s,1H);5.440 (s,1H);5.082,5.013 (s,1H,1H,=CH2);2.591～2.663 (m,2H,-CH2-);2.269～2.341 (m,2H);1.929～2.057(m,6H);1.189(s,3H);0.979(s,3H)。

13C NMR (δ,ppm,100 MHz,CDCl3)：207.3;187.1;167.8;153.9;145.2;143.6;127.8;122.8;119.3;112.5;49.9;48.2;47.8;43.7;39.3;34.9;31.2;29.2;22.04;19.7;14.2。

2.2 不同条件下制备6,16-二亚甲基雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮（I）

在150 mL 的三口反应瓶中依次加入依西美坦（14.80 g，0.050 mol）、多聚甲醛、二甲胺盐酸盐，65 mL 乙醇于一定温度下搅拌反应，薄层色谱跟踪检测反应至结束，减压旋干后，过柱得到目标化合物（I），计算收率，见表1。

表1 不同条件下化合物（I）收率

实验发现，该反应中最佳投料比为依西美坦:多聚甲醛:二甲胺盐酸盐=1:1.1:0.1（摩尔比），最佳反应温度为78.3 ℃，即回流温度。

2.3 6,16-二亚甲基雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮（I）体外抗肿瘤活性实验

采用国际通用的噻唑蓝法（MTT 法）进行，对化合物（I）进行体外肿瘤细胞抑制活性实验。首先，在96 孔细胞板上接种4×104个对数生长期的肿瘤细胞，分别为胃癌细胞株（MKN45）、肺癌细胞（HCC-78）、人乳腺癌细胞（MDA-MB-231）、肝癌细胞（HepG2）、卵巢癌细胞（3AO）；按每孔5000个细胞铺板，5 个复孔，细胞贴壁后，再加入不同浓度待测样品（I）。本实验共设置6 个药物浓度梯度，分别为：1.0，5.0，25，125，250 和500（单μmol/L）的化合物样品组；空白组加入含5% 胎牛血清（FBS）的DMEM 培养基（一种含各种氨基酸和葡萄糖的培养基），二甲基亚砜组（DMSO 组）加入含1% DMSO 的完全培养液；72 h 后，于96 孔板对应孔中加入5 mg/mL MTT 溶液20 μL，继续培养3 h，弃去孔板中上清液，加入150 μL 的DMSO，用摇床摇匀（10 min，60 次/min），使甲瓒充分溶解。待细胞内蓝紫色结晶溶解后，利用酶标仪测定其490 nm 处吸光度值（OD490），计算化合物（I）对细胞生长的半数抑制浓度IC50。

表2 化合物（I）对不同肿瘤细胞株的IC50

实验结果表明，雄烯二酮衍生物（I）能够抑制多种肿瘤细胞的生长，其中对人乳腺癌细胞（MDA-MB-231）和卵巢癌细胞（3AO）抑制效果较好。

3 总结与展望

本文设计了一种雄烯二酮衍生物——6,16-二亚甲基雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮（I）的制备方法：以依西美坦和多聚甲醛为原料，二甲胺盐酸盐为催化剂，乙醇为溶剂，采用一锅法一步反应直接合成目标产物（I），并通过气相色谱-质谱法、核磁共振波谱法等确认了结构。最佳反应条件为：投料比为n(依西美坦):n(多聚甲醛):n(二甲胺盐酸盐)=1:1.1:0.1，反应温度为78.3 ℃，即回流温度。同时，本文对该化合物的体外抗肿瘤活性进行了实验，结果表明化合物（I）对人乳腺癌细胞（MDA-MB-231）和卵巢癌细胞（3AO）抑制效果较好。开发新的具有甾体母核的芳香酶抑制剂是未来值得长期研究的课题方向。本研究可为新型甾体类抗乳腺癌药物的开发提供借鉴和参考。