肉桂多糖的结构分析及抗氧化活性研究

2022-07-06李胜男毕良武曾维星陈玉湘赵振东

林产化学与工业 2022年3期

李胜男，程贤，毕良武*，曾维星，陈玉湘，赵振东

(1.中国林业科学研究院林产化学工业研究所；生物质化学利用国家工程实验室；国家林业和草原局林产化学工程重点实验室；江苏省生物质能源与材料重点实验室，江苏南京 210042；2.南京林业大学江苏省林业资源高效加工利用协同创新中心，江苏南京 210037)

肉桂(CinnamomumcassiaPresl)是樟科樟属树种，主要分布在我国的广东、广西等省区[1]。肉桂的化学成分包括多糖类化合物、倍半萜、二萜及糖苷类化合物、黄酮类化合物等，具有抗氧化、抗菌、抗肿瘤、加强消化功能以及镇痛等作用[2-4]。相关研究表明肉桂精油具有很好的抗氧化活性，肉桂水提液中的非挥发性成分也具有抗氧化活性[5-6]。郭占京等[7]研究肉桂水提液对大鼠脑缺血再灌注损伤后脑、心、肝、肾组织中丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)的影响，结果表明：肉桂水提液可以保护脑缺血再灌注损伤，其作用机制与抗脂质过氧化有关。黄宏妙等[8]研究肉桂水提液对大鼠全脑缺血再灌注损伤的保护作用，结果表明：肉桂水提液能降低大鼠脑组织中的MDA，增加SOD和谷胱甘肽过氧化物酶(gsh-px)的活性。肉桂水提物的主要化学成分有多糖和多酚，多糖作为保健食物，具有抗缺氧、增强体质、延缓衰老、抗疲劳等功能。植物多糖的种类不同，生理活性也不同，如降血脂、降血糖、降血清过氧化脂质、抗血凝等[9]。目前关于肉桂多糖的化学结构没有充分的实验数据，并且缺乏肉桂多糖抗氧化方面的相关报道。本实验主要就肉桂多糖的分级分离、结构分析和抗氧化活性展开研究，以期为开发相关保健药品或食品提供一定的理论基础。

1 实验

1.1 原料、试剂与仪器

肉桂水提物(CE)、二乙氨乙基(DEAE)纤维素DE-52离子交换树脂、丙烯葡聚糖凝胶S-300、 1-苯基-3-甲基-5-吡唑酮(PMP)、木糖、甘露糖、葡萄糖、岩藻糖和半乳糖，均为标准品；盐酸、吡啶、乙酸酐、乙酸铵、硼氢化钠、甲醇、冰乙酸、二甲基亚砜、重水(D2O)、氯仿、氢氧化钠，均为市售分析纯。DPPH自由基(DPPH·)清除能力试剂盒、总抗氧化能力(T-AOC)测试盒、植物可溶性糖检测试剂盒、蛋白定量测试盒，均购自南京建成生物工程研究所。

Agilent PL-GPC50/Agilent 1260高效液相色谱(HPLC)仪；迷你离心机；XH-C涡旋混合器；旋转蒸发仪；赛默飞世尔 THERMO(带孵育器)Multiskan FC 全自动酶标仪，北京澎昆博远科贸发展有限责任公司；冷冻干燥机；Bruker DRX400M 型核磁共振(NMR)仪，德国Bruker公司。

1.2 肉桂水提物的纯化

1.2.1肉桂水提物(CE)除蛋白参照文献[10]并进行稍微改进，用蒸馏水将CE溶解，加入Sevage试剂(氯仿/正丁醇，体积比5 ∶1)，CE与Sevage试剂按体积比4 ∶1混合，振荡20 min，然后离心，转速为9 000 r/min，时间为10 min，吸取上层溶液，重复4次，冷冻干燥后，可得肉桂粗多糖。

1.2.2离子交换柱层析参照文献[11]，取肉桂粗多糖108 mg，充分溶解于1.5 mL蒸馏水中，上样于DEAE纤维素DE-52离子交换树脂层析柱中，柱体积为30 mL(φ1.2×30 cm)，依次用蒸馏水、 0.2、 0.4、 0.8、 1.2和2.0 mol/L的氯化钠溶液进行梯度洗脱，流速为0.8 mL/min，9 mL/管收集。

1.2.3葡聚糖凝胶柱层析参照文献[12]并进行改进，取1.2.2节分离得到的肉桂多糖组分，通过丙烯葡聚糖凝胶S-300层析柱，用蒸馏水洗脱，柱体积为150 mL(φ1.8×70 cm)，流速为0.4 mL/min，4.5 mL/管收集，浓缩，冷冻干燥，得到纯化的肉桂多糖组分。

1.3 肉桂中性多糖的含量测定和结构表征

1.3.1多糖和蛋白质含量测定对1.2.2节和1.2.3节收集到的样品分别采用苯酚硫酸法检测多糖含量并绘制层析曲线；采用植物可溶性糖检测试剂盒和蛋白定量测试盒对1.2.3节中得到的纯化肉桂多糖进行总糖含量以及蛋白质含量的测定。

1.3.2相对分子质量(Mr)测定采用凝胶渗透色谱(GPC)法，对纯化肉桂多糖的重均相对分子质量(Mw)进行测定。色谱条件：流动相为NaNO3溶液，流速为1 mL/min，柱温30 ℃，进样量50 μL，运行时间30 min，示差折光检测器，以标准葡聚糖的保留时间和Mr各取自然对数绘制标准曲线，计算CNP的Mw。

1.3.3多糖的结构表征取CNP 4 mg置于10 mL的离心管中，加入1 mL盐酸溶液(6 mol/L)，在70 ℃水浴中加热30 min，冷却，滴加氢氧化钠溶液(200 g/L)至中性，加水至刻度(4 mL)的位置，混匀，过滤取滤液。参照文献[13]，取甘露糖、葡萄糖、半乳糖、木糖、岩藻糖用蒸馏水配置成1 g/L的样品，并取各单糖样品、单糖混合物及滤液400 μL，加0.5 mol/L PMP甲醇溶液450 μL，0.3 mol/L氢氧化钠450 μL，混合均匀，70 ℃水浴30 min，冷却至室温，加入0.3 mol/L盐酸450 μL，混合均匀，加0.1 mol/L醋酸铵溶液稀释至2 mL，加1 mL氯仿，充分振荡，静置分层，除去下层氯仿，用氯仿同法处理3次，用10 000 r/min的离心，取上清液，进行高效液相色谱检测。色谱柱条件为：柱温箱为35 ℃，流速为1 mL/min，紫外检测波长为245 nm，进样量为5 μL，流动相A为0.02 mol/L的KH2PO4缓冲溶液，B为色谱纯乙腈，洗脱条件为0 min→10 min→50 min→60 min→70 min，流动相乙腈为15%→20%→25%→20%→15%。

参照文献[14]，取5 mg肉桂中性多糖溶于1.5 mL DMSO中，超声波处理30 min，待样品溶解后，加入60 mg研磨成粉末的氢氧化钠，超声波处理30 min，之后向样品中加入450 μL的碘甲烷，超声波处理30 min，再加入450 μL碘甲烷[15-16]，超声波处理30 min，加水5 mL终止甲基化，然后用等体积的氯仿萃取1次，之后用等量的水洗涤5次，最后用氮气吹干留下的氯仿溶剂，吹干之后向其中加入1 mL的甲醇，继续氮吹，重复3次，即可完成甲基化。向得到的甲基化产物中加入1.25 mL 6 mol/L盐酸溶液，在70 ℃下水解30 min，冷却、旋干，旋干温度为45 ℃，然后再加入1 mL甲醇旋干。向得到的水解产物中加入2 mL新配置的25 g/L的硼氢化钠室温反应2 h，期间数次振荡，滴加乙酸中和，pH试纸检验，加入0.1 mL甲醇旋干。向获得的还原产物中加入12 mL新配置的吡啶/乙酸酐(体积比1 ∶1)，100 ℃下反应1 h，冷却至室温，旋干，然后加入甲醇4 mL(每次2 mL，重复2次)，旋干，最后加入2 mL二氯甲烷取出液体，离心，取上清液进行GC-MS分析。

取50 mg肉桂中性多糖样品放在核磁管中，以D2O为溶剂，振荡后溶解完全，采用Bruker 400M核磁共振波谱仪进行13C NMR和1H NMR分析。

1.4 肉桂中性多糖体外抗氧化活性

1.4.1清除DPPH·的能力采用DPPH·清除能力试剂盒进行肉桂中性多糖抗氧化能力的测定，此法根据DPPH·有单电子，在517 nm处有强吸收，醇溶液呈紫色的特性。当自由基清除剂存在时，由于与其单电子配对而使其吸收逐渐消失，呈现的颜色越浅，即吸光度越低，肉桂多糖清除自由基的能力越强。向0.4 mL不同质量浓度(0.016、 0.030、 0.060、 0.125、 0.250、 0.500、 1.000和2.000 g/L)的样品溶液中分别加入0.6 mL DPPH·工作液，将混合物摇匀，室温放置30 min，整个实验过程均在避光处进行，在517 nm处使用酶标仪进行吸光度的测定。实验以维生素C(Vc)作为阳性对照，以蒸馏水作为空白对照，测定值为每份样品3次平行试验后的平均值，计算 DPPH·清除率(ηDPPH·)。

式中：A测定—样品液与DPPH溶液混合后的吸光度；A对照—样品液与蒸馏水混合后的吸光度；A空白—蒸馏水与DPPH溶液混合后的吸光度。

1.4.2清除ABTS自由基的能力采用总抗氧化(T-AOC)测试盒进行肉桂中性多糖总抗氧化能力的测定。ABTS在适当的氧化剂作用下氧化成绿色的ABTS自由基(ABTS+·)，在抗氧化物质的存在下，ABTS+·的产生会被抑制，在405 nm测定ABTS+·的吸光度即可测定并计算出样品的总抗氧化能力。以Vc作为阳性对照，蒸馏水作为空白对照，测试样品与对照样品的质量浓度分别为0.016、 0.030、 0.060、 0.125、 0.250、 0.500、 1.000和2.000 g/L，按照测试盒实验步骤要求进行实验，在405 nm处使用酶标仪进行吸光度的测定。测定值为每份样品3次平行试验后的平均值，计算ABTS+·清除率(ηABTS+·)。

式中：A′测定—样品液与ABTS+·工作液混合后的吸光度；A′空白—蒸馏水与ABTS+·工作液混合后的吸光度。

2 结果与讨论

2.1 肉桂水提物纯化结果分析

对除蛋白后的CE进行两步分离纯化，DEAE纤维素DE-52离子交换柱层析曲线见图1(a)。其中，0～9管为蒸馏水洗脱，10～18管为0.2 mol/L NaCl溶液洗脱，19～27管为0.4 mol/L NaCl溶液洗脱，28～36管为0.8 mol/L NaCl溶液洗脱，合并收集第6～8管得到CP-1，收集第13管得到CP-2，其余峰由于紫外吸收较低，故忽略不计。CP-1由蒸馏水洗脱获得，不带电荷，所以初步判定CP-1为中性多糖，CP-2由0.2 mol/L的NaCl溶液梯度洗脱，带有少量负电荷，初步判定为酸性多糖。由于CP-1含量较高，故以CP-1为研究对象。CP-1经丙烯葡聚糖凝胶柱S-300进一步分离，洗脱结果如图1(b)所示。图中存在一个洗脱峰，并且峰型对称良好，将其冷冻干燥，得到纯化的肉桂中性多糖(CNP)，试剂盒检测结果表明：CNP的总糖质量分数为98.38%，蛋白质的质量分数为2.30%。

图1 肉桂多糖的离子交换柱层析(a)和肉桂中性多糖的凝胶柱层析(b)曲线Fig.1 Ion exchange chromatography curve of cinnamon polysaccharide(a) and GPC curve of CNP(b)

2.2 多糖的相对分子质量及单糖组成分析

2.2.1相对分子质量(Mr)测定影响天然多糖活性的重要特征数据是Mr，在GPC法测定多糖Mr的结果中，CNP的聚合物分散指数(PDI)为1.585，故Mr分布较均匀，重均相对分子质量(Mw)为3 630，可以归属为小分子多糖。

2.2.2多糖的结构表征选取单糖标准溶液和CNP进行PMP衍生化，HPLC分析单糖组分。如图2所示，衍生试剂PMP最先出峰，对其他单糖检测结果无明显干扰，5种单糖的衍生物在60 min内实现良好的分离。对比CNP样品和混合标准单糖溶液色谱峰的保留时间，结果显示D-甘露糖、D-葡萄糖、D-半乳糖、D-木糖和D-岩藻糖的出峰时间分别为16.341、 28.749、 30.156、 32.608和36.251 min，而CNP只有一个单峰，出峰时间为29.413 min，因此可以推断肉桂多糖的单糖组成为葡萄糖，属于均一性多糖。

1.甘露糖mannose; 2.葡萄糖glucose; 3.半乳糖galactose; 4.木糖xylose; 5.岩藻糖fucose

甲基化反应后，CNP经过水解、还原、乙酰化，得到部分甲基化的糖醇乙酰酯衍生物(PMAA)，然后进行GC/MS分析，通过对GC峰的质谱进行解析，即可知道糖苷键的连接方式。以→4)Glu(1→的连接方式为例，解释并说明PMAA的电离规律和图谱解析(图3)。

图3 →4)Glu(1→的PMAA的电离情况(a)及质谱图(b)Fig.3 Ionization(a) and mass spectrum(b) of PMAA of →4)Glu(1→

→4)Glu(1→的PMAA为1，4，5-Ac3-2，3，6-Me3-Glu，Mr为350。根据文献[13]所述，两个甲基化的碳原子之间最易断裂，如C2和C3或C4和C5之间易发生断裂，所以m/z117、m/z233的丰度较高(图3(a))，之后初级离子片段继续电离；如初级离子m/z233、m/z117脱落CHOH(m/z30)产生m/z203、m/z87的次级离子，次级离子(m/z203)继续电离除去CH2CO(m/z42)，得到m/z161。综上所述，1，4-

Ac2-2，3，6-Me3-Glu在质谱m/z203、 87、 161均有的离子丰度。图3(b)质谱图中m/z87、 117、 161.1、 183、 233.1的分度较高，并且均为1，4-Ac2-2，3，6-Me3-Glu的特征峰，因此推断CNP的甲基化产物包含1，4，5-Ac3-2，3，6-Me3-Glu，进一步推断CNP的碳链结构中含有→4)Glu(1→。同理可推测单糖的其他连接方式，如表1所示。

表1 CNP的甲基化分析结果Table 1 Methylation result of CNP

如图4(a)所示，在CNP的1H NMR谱中，δH5.333是葡萄糖的端基氢信号，可进一步归属于Glu(1→的氢信号，与甲基化分析结果一致，同时表明肉桂多糖中末端链接的葡萄糖以α构型为主。δH3.857～3.904，J=18.8，可以归属于→4)Glu(1→和→6)Glu(1→的氢信号，与甲基化分析结果相吻合，同时表明肉桂多糖中主链连接的葡萄糖以β构型为主。在CNP的13C NMR谱中，δC99.42可归属于Glu(1→的碳信号，δC71.00～73.13可归属于→6)Glu(1→的碳信号，与甲基化的分析结果一致。

图4 CNP的1H NMR(a)和13C NMR(b)谱Fig.4 1H NMR(a) and 13C NMR(b) spectra of CNP

2.3 肉桂多糖体外抗氧化活性分析

2.3.1对DPPH·的清除效果由图5(a)可知，0.016～2 g/L的质量浓度范围内，Vc、CNP和CE均是随着质量浓度的增加，抗氧化活性逐渐增加。

由于Vc抗氧化活性很强，故很快达到抗氧化活性最高值，CNP虽然在低浓度下，抗氧化活性不及Vc，但当质量浓度为0.5 g/L时对DPPH·的消除率与Vc相当，约为84%，而CE的抗氧化活性明显低于CNP。

2.3.2对ABTS+·的清除效果由图 5(b)可知，在0.016～2 g/L的质量浓度范围内，Vc、CNP和CE均是随着质量浓度的增加，抗氧化活性逐渐增加。由于Vc的抗氧化活性较强，故在0.25 g/L时达到最高值91.5%，而CNP在同浓度下对ABTS+·清除率仅为6.4%，但是随着浓度的升高，CNP的抗氧化能力逐渐增强，当质量浓度为2 g/L时，CNP对ABTS+·清除率可达到60%，明显高于同浓度的CE。