N-(α-桐酸酰基)三唑类化合物的制备及其生物活性

成 江， 谢普军， 黄立新*， 张彩虹， 刘璐婕

(1.中国林业科学研究院 林产化学工业研究所；生物质化学利用国家工程实验室；国家林业和草原局林产化学工程重点实验室；江苏省生物质能源与材料重点实验室，江苏 南京 210042；2.南京林业大学 江苏省林业资源高效加工利用协同创新中心，江苏 南京 210037)

近年来，三唑环被发现是药物中的关键结构基团[1]，广泛存在于各种药物、天然产物和生物活性化合物中。其中，含脂肪链的三唑衍生物也被发现具有良好的生物活性[2-3]。Ahmad等[4]合成了长链取代的1,2,4-三唑-3-硫酮衍生物，抗癌活性结果表明：所有测试的化合物对肝癌细胞的抑制活性显著，其对Hep3 B细胞的最强半数抑制浓度(IC50)为7.4 μmol/L，可以在不损害正常细胞的情况下对癌症进行治疗。Sharma等[5]合成了一系列具有脂肪链的新型三唑，并在体外评价其对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌的抑制活性，结果表明：部分化合物对所测试的细菌菌株的生长表现出显著的抑制活性，且所有化合物对白色念珠菌也表现出较好的抑制作用(抑制圈直径范围为17.2～19.03 mm)。随着新药开发需求的不断提高，以天然产物为先导来设计新型的生物活性制剂成为研究的热点。α-桐酸是具有3个不饱和共轭结构的十八碳烯酸，是一种大量存在于种子油中的天然产物。在从10种苦瓜种子中提取的油中，α-桐酸占其总脂肪酸的30%～60%[6]。而在桐油中，α-桐酸占其总脂肪酸的77%～82%[7-8]。α-桐酸已被证明具有多种生物活性，如抗炎和调节体内脂质代谢[9-10]，还可以通过促进膜内脂质过氧化诱导细胞凋亡来选择性地抑制肿瘤[11]。为了寻求具有潜在生物活性的脂肪链三唑类化合物，本研究以α-桐酸为原料合成一系列N-(α-桐酸酰基)三唑类化合物，并对其抗菌和抗肿瘤活性进行评价，以期为α-桐酸的高值化利用提供参考。

1 实 验

1.1 材料、试剂和仪器

α-桐酸(纯度98%)，自制[12]。草酰氯、三乙胺、二氯甲烷、 3,5-二溴-1,2,4-三氮唑、 1,2,4-三氮唑、 3-巯基-1,2,4-三氮唑、 3-硝基-1,2,4-三氮唑、苯骈三氮唑、 3-氨基-1,2,4-三氮唑、 4-氨基-1,2,4-三氮唑，均为市售分析纯。金黄色葡萄球菌(Staphyloccocusaureus)、大肠杆菌(Escherichiacoli)、白色念珠菌(Candidaalbicans), 购自北京北纳创联生物技术研究所；人肝癌细胞(Hep G2)、人直肠癌细胞(DLD-1)、人乳腺癌细胞(MCF-7)，由江苏凯基生物技术有限公司提供。Nicolet iS10 型红外光谱(FT-IR)仪，美国 Thermo公司；Avance III型核磁共振(NMR)仪，瑞士Bruker公司；Q Exactive型液相色谱质谱联用(LC-MS)仪，美国Thermo公司。

1.2 α-桐酸酰胺类化合物的合成

1.2.1合成路线 N-(α-桐酸酰基)三唑类化合物的合成路线如图 1 所示。

图1 N-(α-桐酸酰基)三唑类化合物的合成路线Fig.1 The synthetic route of N-(α-eleostearic acyl) triazole derivatives

1.2.2α-桐酸酰氯(2)的制备 称取56 g自制的α-桐酸(1)溶于50 mL二氯甲烷中，加入到150 mL烧瓶中并充入氮气保护；在冰浴条件下，取30 mL质量浓度为1 g/mL的草酰氯的二氯甲烷溶液缓慢滴加到烧瓶中。室温反应3 h后，减压蒸除溶剂和多余的草酰氯，得到黄色液体即为α-桐酸酰氯(2)，置于冰箱中备用。

1.2.3化合物3a～3g的制备 参考文献[3]方法，称取一定量的三乙胺和三唑置于50 mL的烧瓶中，加入二氯甲烷搅拌混合均匀。在冰浴条件下，往烧瓶中缓慢滴加α-桐酸酰氯的二氯甲烷溶液，滴加完毕后继续搅拌，薄层色谱(TLC)跟踪反应进程。反应结束后用饱和碳酸氢钠溶液和蒸馏水洗涤至中性，收集有机相。减压蒸馏后得到的粗产品通过硅胶柱层析，分离得到N-(α-桐酸酰基)三唑类化合物3a～3g。

1.3 生物活性实验

1.3.1抗肿瘤活性 用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法测定N-(α-桐酸酰基)三唑类化合物对于癌细胞的抑制能力[13]。首先，使用0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA消化收集对数生长期的人肿瘤细胞。用缓冲盐水洗涤后，与10%胎牛血清(FBS)、缓冲溶液混合，制成细胞悬液，转移到新鲜的培养基中，置于37 ℃、 5%CO2饱和湿度恒温恒湿培养箱中培养。然后，将细胞计数后，接种到96孔板中，每孔约3×104个细胞。药品浓度的选择参照文献中的方法[4,14]，配制浓度为20和200 μmol/L的α-桐酸酰胺衍生物的二甲亚砜(DMSO)溶液。之后，把配制好的溶液分别加入到接种好细胞的96孔板中，处理72 h。按照同样的浓度处理5-氟尿嘧啶(5-Fu)作阳性对照，仅加入相同体积的培养基作阴性对照，每个化合物和对照组均设置5个复孔。处理后，将MTT(0.5 g/L)加入培养基中，并将细胞在37 ℃下、 5% CO2饱和湿度条件下培养4 h，弃去上清液，按150 μL/孔加入DMSO，轻微振摇若干分钟，使结晶完全溶解。用酶标仪在490 nm处测量溶液的光密度(OD)值，化合物对癌细胞的抑制率按式(1)计算：

(1)

式中：η—抑制率，%；NOD—阴性对照组OD值；EOD—实验组OD值。

1.3.2抑菌活性 参考Maneedaeng等[15]的方法进行抑菌实验。配制Mueller-Hinton(MH)肉汤培养基和马铃薯葡萄糖水(PDB)培养基各500 mL，高压灭菌。在装有100 mL肉汤的锥形瓶中，分别接种金黄色葡萄球菌和大肠杆菌，在装有100 mL PDB培养基的锥形瓶中，接种白色念珠菌，在37 ℃下孵育24 h。孵育后，将培养液的悬浮液用无菌水调节至菌液浓度为108CFU/mL。在96孔板的第一个孔中加入溶于DMSO的N-(α-桐酸酰基)三唑类化合物，质量浓度为500 mg/L。之后的各孔均稀释为前一孔浓度的一半，各孔的质量浓度范围为0.977～500 mg/L。同时，设置阴性对照组和阳性对照组，阳性对照组中加入等量的氨苄青霉素钠和5-氟胞嘧啶，阴性对照组中加入等量的对应溶剂。然后，在每个孔中加入75 μL先前制备的细菌悬液，并将板在37 ℃下孵育24 h。用酶标仪在600 nm处测量各孔的OD值，实验中每组设置5个平行，化合物对菌的抑制率按式(1)计算。

2 结果与讨论

2.1 α-桐酸酰胺类化合物合成与结构鉴定

2.2 化合物3a～3g的生物活性

2.2.1抗肿瘤活性 将所有合成的化合物3a～3g对照人肝癌细胞(Hep G2)、人直肠癌细胞(DLD-1)和人乳腺癌(MCF-7)进行筛选，并将5-氟尿嘧啶(5-Fu)用作标准阳性对照。所有合成化合物在浓度为200和20 μmol/L时抑制癌细胞的结果如表1所示。

表1 不同浓度的化合物3a～3g对人体癌细胞的抑制率Table 1 Inhibition rates of different concentrations of compounds 3a-3g on human cancer cells

由表1可知，当化合物浓度为20 μmol/L时，大多数测试的化合物显示出对癌细胞的低细胞毒性作用，抗肿瘤效果不明显。仅有3d在20 μmol/L浓度下显示出对人乳腺癌细胞MCF-7较高的抑制作用。当浓度为200 μmol/L时，化合物3a、3d和3e对癌细胞均有一定的抑制效果，其中，化合物3a和3e对3种癌细胞均有显著的抑制作用，抑制率均超过80%。化合物3d对人乳腺癌细胞MCF-7具有很强的抑制活性，抑制率达到了92.83%，与阳性对照5-Fu的抑制效果相当。从化合物3a～3g对不同癌细胞的抑制效果可以看出，不同结构的取代基对化合物的抗肿瘤活性也有影响，在三唑环上引入卤素和苯环使得化合物3a和3e对所有3种癌细胞的抑制活性增加。随着化合物中三唑环上取代基种类的不同，化合物对于人乳腺癌MCF-7的抑制作用也有所差异。其中，三唑环上硝基取代的化合物3d对于乳腺癌MCF-7 的抑制作用最显著。而对于人直肠癌DLD-1和肝癌Hep G2，最理想的是含有苯环的三唑(3e)。

根据表1中不同浓度的化合物3a～3g对人体癌细胞的抑制效果，选取抗肿瘤活性较好的化合物3a、3d和3e采用1.3.1节方法，测定其半数抑制浓度(IC50)，结果见表2。从表2可以看出，对人体肿瘤细胞Hep G2、DLD-1和MCF-7而言，化合物3a较3e的抗肿瘤活性更好，其IC50分别为112.76、 101.22和97.99 μmol/L。化合物3d对人乳腺癌细胞MCF-7的IC50为25.12 μmol/L，抑制效果强于阳性对照物5-Fu，具有作为药物开发的潜力。

表2 化合物3a、 3d和3e对人癌细胞的IC50Table 2 IC50 of compounds 3a, 3d and 3e on human cancer cells

2.2.2抑菌活性 将所有合成的化合物3a～3g对2种细菌菌株(大肠杆菌和金黄色葡萄球菌)和1种真菌菌株(白色念球菌)进行了抗菌活性检测，结果如表3所示。从表3可以看出，化合物3a～3g对白色念珠菌均有抑制作用，但大多数化合物无法抑制2种细菌的生长。化合物3e显示出较好的抗细菌活性，其对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的IC50分别为148.2和457.83 mg/L，而其他化合物对这2种细菌的IC50均大于500 mg/L。此外，化合物3e显示出优异的抗白色念珠菌活性，其对白色念珠菌的IC50为22.69 mg/L，与阳性对照5-氟胞嘧啶的抗菌效果相近。从构效关系的角度来看，3e和其他化合物之间的主要结构差异是含有苯环。有研究指出[16]，化合物含有的供电子或吸电子基团能够影响微生物生物膜的形成，从而提高化合物的抗微生物活性。化合物3e中三唑环受到苯环的影响，整体的电子云密度发生了变化，可能对目标化合物抗菌作用起到了积极作用。

表3 化合物3a～3g对微生物的抑制效果(24 h)Table 3 The inhibitory effect of compound 3a-3g on microorganism(24 h)

3 结 论

3.1以α-桐酸为原料，制备得到7个新型的N-(α-桐酸酰基)三唑类化合物：N-(α-桐酸酰基)-3,5-二溴-1,2,4-三唑(3a)、N-(α-桐酸酰基)-1,2,4-三唑(3b)、N-(α-桐酸酰基)-3-巯基-1,2,4-三唑(3c)、N-(α-桐酸酰基)-5-硝基-1,2,4-三唑(3d)、N-(α-桐酸酰基)-1,2,3苯骈三唑(3e)、 3-α-桐酸酰基-1,2,4-三唑(3f)、 4-α-桐酸酰基-1,2,4-三唑(3g)。采用FT-IR、1H NMR、13C NMR和MS等方法对化合物结构进行了确证。

3.2探讨了7种N-(α-桐酸酰基)三唑类化合物的抑菌及抗肿瘤活性，结果表明：化合物3a和3e对人肝癌细胞(Hep G2)、人直肠癌细胞(DLD-1)和人乳腺癌(MCF-7)均有较好的抑制效果。其中，化合物3d对人乳腺癌细胞MCF-7具有很强的抑制活性，抑制率达到了92.83%，半数抑制浓度(IC50)为25.12 μmol/L，抑制效果强于阳性对照物5-氟尿嘧啶(5-Fu)，具有作为药物开发的潜力。所有化合物对白色念珠菌的抑制效果良好，化合物3e显示出优异的抗白色念珠菌活性，其IC50达到22.69 mg/L，与阳性对照的抗菌效果相近。这些结果对后续α-桐酸衍生物的结构优化与改造研究具有指导意义。