早期分泌抗原靶6及免疫和炎症指标对抗结核药物性肝损伤的诊断价值

陆霓虹 沈凌筠 刘洪璐 陈杨君 杨艳 杜映荣

目前，四联抗结核药物治疗方案是最有效的治疗肺结核(pulmonary tuberculosis，PTB)的方法[1]。但是随着抗结核药物性肝损伤(anti-tuberculosis drug-induced liver injury，ATB-DILI)的发生率不断上升，停用抗结核药物导致的结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)耐药率也在明显增加[2]。如何降低ATB-DILI的发生率，探寻其临床影响因素已是目前ATB-DILI防治研究的热点。早期分泌抗原靶6(early secreted antigenic target-6，ESAT-6)作为结核分枝杆菌毒力因子，可诱发机体产生炎症反应，从而产生多种参与肝损伤后不同阶段炎症和修复过程的炎症因子[3]，主要体现了MTB感染的严重性。而MTB感染引起的一系列炎症反应，又可引起炎性因子的表达上调，其中包括新的与肝损伤密切相关的可降解细胞外基质和激活人类肝星状细胞的基质金属蛋白酶9(matrix metalloprotein，MMP-9)和MMP-14[4]。因此，笔者拟通过分析免疫指标、炎症指标、ESAT-6和MMP在ATB-DILI患者中的表达，发现新的与ATB-DILI发生相关的评估因子及影响因素，为ATB-DILI的早期诊断及预防提供更多临床依据。

对象和方法

一、研究对象

选择2019年1月至2021年1月昆明市第三人民医院收治的符合入组标准的肺结核患者325例，其中发生ATB-DILI的患者115例(A组)，未发生肝损伤的患者210例(B组)；同时收集同期门诊的健康体检者98名(C组)。研究经昆明市第三人民医院伦理委员会批准(编号：201902313)，所有入组患者均告知研究目的并签署知情同意书。

A组中，男性患者70例(60.7%)，女性患者45例(39.3%)；年龄范围为18～79岁，年龄中位数(四分位数)为51.2(18.9，77.2)岁；体质量指数(BMI)为18.2±3.5。B组中，男性患者122例(58.1%)，女性患者88例(41.9%)，年龄范围为19～61岁，年龄中位数(四分位数)为39.1(19.7，63.3)岁；BMI为20.6±2.8。C组中，男性55名(56.1%)，女性43名(43.9%)，年龄范围为20～59岁，年龄中位数(四分位数)为36.3(20.1，61.3)岁；BMI为21.2±2.5。3组对象的年龄总体差异有统计学意义(H=29.721，P=0.000)，其中A组与B组、C组的年龄差异均有统计学意义(H=27.695，P=0.000；H=29.982，P=0.000)，但B组和C组年龄的差异无统计学意义(H=3.245，P=0.137)；性别、BMI的差异均无统计学意义(χ2=0.506，P=0.776；F=0.735，P=0.415)。

二、研究方法

1.患者入组标准：纳入首次住院诊断肺结核患者作为A组和B组。排除既往患各类型肝炎者；患各类免疫功能低下疾病(肿瘤、糖尿病等)者；接受免疫抑制剂治疗者；使用其他导致药物性肝损伤药物者；非首次确诊肺结核或耐药肺结核者。

2.临床诊断标准：(1)肺结核：按照《WS 288—2017肺结核诊断》[5]的相关标准，纳入患者为临床诊断及确诊病例；(2)ATB-DILI诊断：指使用2H-R-Z-E/4H-R抗结核治疗方案后，患者在治疗过程中出现与抗结核药物使用直接相关的肝损伤。诊断标准符合中华医学会结核病学分会制定的《抗结核药物肝损伤诊治指南(2019年版)》[6]。

3.检测指标及方法：(1)白细胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、血清降钙素原(procalcitonin，PCT)、C-反应蛋白(C-reactive protein，CRP)、D-二聚体(D-dimer，D-D)和T淋巴细胞亚群(CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞)：抽取患者清晨空腹血，采用全自动生化分析仪检测肝功能、凝血功能、感染指标，试剂盒购自瑞士罗氏公司及美国RD公司；使用美国BD公司FACSCalibur型流式细胞仪检测T淋巴细胞亚群。(2)ESAT-6、MMP-9和MMP-14：血清管收集各组空腹静脉血5 ml，4 ℃低速离心机中以2000 r/min离心5 min，离心半径为16.80 cm，收集上清液于冻存管中。标本使用海尔4 ℃/-20 ℃冰箱保存。使用上海酶联生物公司的酶联免疫分析(ELISA)试剂盒(货号分别为ml037353、ml058617、ml026258)和蛋白酶标仪(美国Molecular Innovations公司的SPECTCA MAX190)采用双抗体夹心法检测血清ESAT-6、MMP-9、MMP-14的浓度。其中，使用酶标仪测定450 nm波长下吸光度值，通过标准曲线计算血清样本中不同MMP的含量；使用酶标仪检测450 nm波长下吸光度值，根据标准品浓度和吸光度值做出标准曲线并计算回归方程，再根据所得回归方程计算ESAT-6蛋白含量。

三、统计学处理

应用SPSS 26.0软件对数据进行统计分析。偏态分布的计量资料以“中位数(四分位数)[M(Q1，Q3)]”描述，组间差异的比较采用Kruskal-Wallis秩和检验，总体差异的比较选用Kruskal-Wallis单因素ANOVA(k样本)检验。使用多因素logistic回归模型分析导致ATB-DILI发生的危险因素。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、 不同炎性指标在3组研究对象中的检测情况

3组研究对象的CD4+T淋巴细胞计数、PCT和D-D的差异均有统计学意义(P值均<0.05)；CRP、IL-6总体的差异均无统计学意义(P值均>0.05)。各组间两两比较，仅CD4+T淋巴细胞计数、PCT和D-D的差异有统计学意义(P值均<0.05)。具体见表1。

表1 不同炎性指标在3组研究对象中的检测情况

二、不同免疫指标在3组中的检测情况

与C组比较，ESAT-6在A组与B组表达均升高，3组总体差异有统计学意义(P<0.05)；进一步进行组间两两比较，3组间差异均有统计学意义(P值均<0.05)。MMP-9、MMP-14在A组和B组表达均升高，3组总体差异均有统计学意义(P值均<0.05)；进一步组间对比分析，MMP-14在A组与C组、B组与C组间的差异均有统计学意义(P值均<0.05)，在A组与B组间的差异无统计学意义(P>0.05)；而MMP-9在3组中各组间的两两比较差异均有统计学意义(P值均<0.05)，具体见表2。

表2 ESAT-6、MMP-9、MMP-14在3组研究对象中的检测情况

表3 logistic回归分析变量赋值表

三、ATB-DILI发生的影响因素分析

参照上文检测结果，以是否发生ATB-DILI为因变量，将差异有统计学意义的年龄、CD4+T淋巴细胞计数、PCT、D-二聚体、ESAT-6、MMP-9、MMP-14纳入到多因素模型中进行分析(赋值变量见表3)，结果显示：年龄>65岁、ESAT-6>30.5 pg/ml是发生ATB-DILI的独立危险因素，具体见表4。

表4 与ATB-DILI发生相关因素的logistic回归分析

讨 论

ATB-DILI的发生在PTB的治疗过程中越来越常见，占PTB患者的10%[7]，严重影响PTB的全程规范治疗，导致治疗中断、抗结核药物的耐药率上升[8]。如何预防ATB-DILI的发生及发展是目前ATB-DILI临床研究的重点。

有研究报道，发生ATB-DILI的PTB患者年龄较大，BMI偏低，提示高龄患者更易发生ATB-DILI。考虑与老年人整体机能减退，营养状况、机体免疫功能、心肺负荷状态均较年轻PTB患者下降，尤其是肝脏的代谢功能减退，使其不能及时缓解抗结核药物所致的急性炎症反应及免疫反应有关[9-10]。本研究结果显示，发生ATB-DILI的PTB患者年龄明显高于未发生ATB-DILI的患者；多因素分析结果也显示，高龄是发生ATB-DILI的独立危险因素，与文献报道相符[9-11]，这提示对高龄PTB患者应及时应用预防性保肝药物，可能会降低ATB-DILI的发生风险。

ATB-DILI的发生及进展机制目前仍未明了，有研究认为可能与炎症机制相关[12]。抗结核药物杀死MTB的同时促进了机体释放炎症因子，导致肝细胞损伤及凋亡[13]。PCT性能稳定，是一种无激素活性的降钙素前肽物质，不易受免疫功能低下、心功能损伤等干扰，在机体正常状态下，可由甲状腺髓质细胞分泌，但在机体炎症状态下，则与多种炎症反应密切相关[14]，故目前已广泛应用于感染程度的评估及指导临床抗生素的使用[15]。本研究结果显示，病例组PTB患者的PCT值均高于健康对照组，且在发生ATB-DILI与未发生ATB-DILI的患者间的差异有统计学意义，这可能与炎症因子可以导致肝脏固有免疫细胞间的不平衡，引起机体的免疫反应，进一步加重肝细胞损伤，促使肝纤维化的发生和发展[16]有关，提示炎症机制可能是ATB-DILI发生的原因之一。D-二聚体是纤维蛋白单体经活化因子交联后产生的一种特异性降解产物，在重症感染及组织坏死的情况下可升高[17]。本研究结果显示，发生ATB-DILI的PTB患者D-二聚体升高，明显高于未发生ATB-DILI的患者，提示ATB-DILI的发生可能与炎症反应下机体血液高凝状态有关。

有研究发现，人体的呼吸系统会随着MTB感染及播散不断地经历巨噬细胞的吞噬及释放，且在MTB攻击呼吸道上皮细胞的同时，也吸引机体淋巴细胞的攻击与杀灭[18]。由此认为结核病的发生与患者的免疫状况密切相关。本研究显示，PTB患者与健康对照组相比T淋巴细胞明显降低，与文献报道一致[19]。机体杀伤MTB过程中消耗大量T淋巴细胞，尤其是CD4+T淋巴细胞，使得PTB患者均有不同程度的免疫功能下降，尤其是CD4+T淋巴细胞的下降明显[20]。另外，肝损伤患者免疫调节功能紊乱，主要表现为体液免疫功能亢进、细胞免疫受抑制[21]。本研究中两组PTB患者均有不同程度的CD4+T淋巴细胞减少，尤其是发生ATB-DILI的患者下降程度明显高于未发生ATB-DILI的患者，研究结论符合目前文献报道[20]。

ESAT-6是MTB早期产生的靶向分泌抗原，具有多项免疫活性特征。本研究采用ELISA方法检测ESAT-6蛋白表达，该方法多用于脑脊液的ESAT-6检测[22]，也有少量文献报道其用于检测血清中的ESAT-6，但因血清中ESAT-6含量较少，MTB大量存活才可能被检测到，存在假阴性的可能。但若在受试者中检测出ESAT-6，则不仅代表有MTB感染，更能预示着MTB已经进入了大量繁殖、感染性和致病性强的阶段。目前，常用的斑点试验是检测抗体，阳性率较高，但对于免疫功能低下的PTB患者无法做出良好的区分，这也是本研究使用ESAT-6抗原检测的原因。研究结果显示，ESAT-6在PTB患者中高表达，在健康对照组中几乎无表达，故认为ESAT-6可用于活动性结核病的辅助诊断。

ESAT-6不仅能促进MTB迁移及播散，破坏肺上皮细胞，加重PTB患者病情[23]，还可以调节炎症因子分泌MMP。MMP是一类Zn2+依赖的蛋白水解酶，参与多项炎症反应及内皮细胞代谢，在健康人群中基本不表达或表达量极低[24]。MMP-9是MMP家族中一员，可以由巨噬细胞、中性粒细胞等多种细胞分泌，在87位氨基酸残基或附近被酶解激活，主要保持酶的活性稳定[25]，并参与多种炎症反应、组织修复、炎症因子的表达等[26]。本研究显示，ESAT-6及MMP-9在发生ATB-DILI的PTB患者中表达明显上升，明显高于未发生ATB-DILI的患者，提示ESAT-6及MMP-9高表达的患者更容易发生ATB-DILI。此外，多因素分析结果表明，ESAT-6升高(>30.5 pg/ml)是PTB患者发生肝损伤的独立危险因素，其原因可能是ESAT-6高表达的PTB患者MTB的侵袭力更强[27]，引起的机体炎症反应更重，导致大量的炎症因子刺激多种分子作用于肝细胞，造成肝细胞线粒体损伤、肝细胞坏死凋亡，发生不同程度的肝损伤[28]。而MMP-9能降解细胞外基质，干扰肝脏细胞-细胞、细胞-基质的相互作用，以及肝星状细胞的活化、增殖及细胞外基质的形成，促进肝损伤及纤维化[29]。MMP-14表达升高也可触发MMP的瀑布式激活，加重炎症反应，溶解细胞周围纤维蛋白，两者是导致ATB-DILI中肝血管损伤发生发展的重要因素，也是导致肝血管增生、促进ATB-DILI后期肝纤维化发生发展的重要因素[30]。但遗憾的是，本研究中MMP-14虽在PTB患者中高表达，但在发生与未发生ATB-DILI的两组PTB患者中未表现出差异，与前期的研究提示MMP-14在肝血管损伤型ATB-DILI患者中高表达[31]不一致，考虑与发生ATB-DILI的患者中肝血管损伤型较少，未发生ATB-DILI的患者纳入数量较多有关。

综上所述，高龄(>65岁)、ESAT-6升高(>30.5 pg/ml)是PTB患者发生ATB-DILI的独立危险因素。针对这类患者进行抗结核药物治疗时，需密切观察其用药反应，提前应用保肝药物，可能对降低ATB-DILI的发生发展的风险具有一定价值。由于本研究入组的数据有限，研究结论可能需要更多样本的支持来进行佐证，后续笔者将开展更大样本的ATB-DILI发生发展的流行病学数据分析及临床研究，以提供更准确更翔实的依据。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突

作者贡献陆霓虹：分析数据及论文撰写；沈凌筠、刘洪璐：数据采集；陈杨君、杨艳：患者临床诊疗及管理；杜映荣：论文修改