大环内酯类抗生素检测方法研究进展

雒晓芳,仇柏林，王婉莹,许 瑾,王迎菲,张禹晗

(1.西北民族大学 实验教学部，甘肃 兰州 730030；2.西北民族大学 生命科学与工程学院，甘肃兰州730030；3.西北民族大学 化工学院 甘肃 兰州 730030)

大环内酯类抗生素作为兽药已广泛应用在临床的预防和治疗中，该类抗生素也逐渐出现在周围土壤、水体等环境中.大环内酯类抗生素在周围土壤中往往呈现出吸附性能较弱，随温度等因素发生变化，对周围环境产生影响[1].吸收过多的抗生素会使动物发育迟缓[2],而含有抗生素的土壤会阻碍植物的生长[3].环境中积聚的抗生素也会影响微生物群体,其抗菌作用会消灭部分菌种,从而破坏环境生态平衡.恶劣的环境会进一步诱导微生物群体使部分菌种产生变异成为耐药菌[4].鉴于此，本文将介绍大环内酯类抗生素的污染现状及检测技术的发展过程，为抗生素残余处理提供理论依据.

1 大环内酯类抗生素

1.1 发展

大环内酯类抗生素是一类常见的在分子结构中分别以12-16个羰基环为母体的抗生素,其结构由于衍生抗生素的出现和抗生素次代的更迭逐渐变得复杂.随着抗生素的不断发展，目前科学家发现了18元新型大环内酯类抗生素及24元大环内酯类酰胺类抗生素等新型抗生素药物.自1952年[5]第一个大环内脂类抗生素红霉素A应用于临床以来，迄今为止发现的大环内酯类抗生素已超过百种.由于红霉素对消化道类疾病、心脑血管疾病等均有较好的治疗效果，从而受到人们青睐，但红霉素的过度使用也使其缺陷显现出来，如滥用会造成心悸、肠胃刺激及人体内环境失调等副作用[6].科学家对其结构进行分析改造，其衍生抗生素第二代大环内酯类抗生素罗红霉素、阿奇霉素和克拉霉素等应运而生，随后第三代大环内酯类抗生素也投入使用.

1.2 生态毒性

大环内酯及其代谢产物的生态毒性主要通过对环境理化性质的影响、环境中动植物的生长繁殖情况的抑制与否是微生物的生长情况来显示.如Nie等[7]发现月牙藻受到红霉素等抗生素的影响，其体内的抗坏血酸合成逐步减慢从而使抗氧化性降低；Qu等[8]对服用阿维菌素后的鸽子进行研究，发现阿维菌素使鸽子的基因发生改变，出现了自噬现象，同时摄入过多阿维菌素会对鸽子的神经细胞和肝脏能力造成损伤[9-10]；Kolar等[11]研究阿维菌素的迁移时发现其对土壤中的生物生存有一定影响；不同浓度的泰乐菌素能够改变浮萍的生长速率，同时控制其色素表达功能[12]；罗红霉素的毒性能使海洋中发光菌的发光强度产生变化[13].由此可知，大环内酯类抗生素在土壤、水域中均能改变生物的正常生理特征，对生物的生存造成了严重的影响，因此需要及时对环境中残留的大环内酯类抗生素进行处理，防止环境中的生物受到影响.

2 大环内酯类抗生素的检测方法

大环内酯类抗生素常用的检测方法有仪器分析法、免疫层快速分析法、电化学分析器法、微生物检测法、毛细管电泳法等.

2.1 仪器分析法

仪器分析法主要是以液相色谱法及其与其他技术联用的检测技术.液相色谱法是通过检测物与两相之间的溶解度差异达到检测的目的.该方法能够高效地检测各种介质中大环内酯类抗生素的含量.但传统的液相色谱法已经无法满足检测的需求，所以将液相法与其他检测技术和样品处理技术联用，以得到更准确高效的检测结果.目前常见的联用方法有液相色谱-质谱分析联用法、液相色谱-四极杆连用法、固相萃取-高效液相色谱联用法等，具体如表1所示.

表1 仪器分析法

QuEChERS法是常见的样品前处理方法，最初被用于蔬菜、水果等植物源样品的测定前处理中，随着研究人员对方法的不断改进，它也被逐步应用于土壤、水中沉积物、动物源样品等其他基质的处理中.通过萃取柱或其他吸附材料对样品中杂质进行吸附，从而达到净化样品的目的.由于QuEChERS法具有回收率高、应用范围广、无二次污染等优点，处理后的样品在液相分析中能够更加高效地被检测出，显著提高了样品检测的效率，因此该方法被广泛应用于抗生素的检测中.在处理大环内酯类抗生素时，该方法通常加入甲酸和乙腈来纯化样品.为使该方法有更好的处理效果，采用具有更好吸附性能的材料，如Islam Abul Kasem Mohammad Mydul将一种新型石墨化炭黑Carbopack Z作为吸附剂，能够显著提高检测的效率[19]；Xu等探究了一种碳纳米管在QuEChERS法中的吸附能力，发现其对样品的纯化能力较强[20].为提高处理能力，还可通过对萃取溶剂、缓冲溶液进行优化.该方法与液相色谱法能够使样品高效准确的检出.

固相萃取法SPE是通过样品与吸附剂的相互作用分离出不含或含较少杂质的被测物，可通过多次萃取过程达到分离复杂样品的目的.对大环内酯类抗生素进行处理时，通常选用甲醇或乙腈进行洗脱.为提高SPE的进化能力，人们探索了多种SPE新型技术，分子印迹固相萃取[21]及新型吸附剂萃取[22]等.这些研究均表现出改进后的SPE技术在抗生素检测方面表现出高灵敏度，但缺乏对大环内酯类抗生素的专项研究，为使SPE法在检测大环内酯类抗生素中发挥更好的作用，需要进一步研究新型材料对抗生素的吸附性能.

串联质谱法是根据不同样品的荷质比对其进行分析并测定，通过质谱图的峰面积可得样品的含量.相较普通质谱法，串联质谱法能够实现对被测离子的多级分离，从多次测定结果中筛选出稳定的数据，避免了因误差造成的干扰.串联质谱法与液相色谱法联用，能够显著提高样品的检测限，使样品的测定更加准确.随着处理技术的不断提高，LC-MC/MC检测的适用范围也越来越广，目前已应用于ERY、ROX、TYL等大环内酯类抗生素的测定.同时，质谱法采用固相萃取作为前处理方法，利用LC-MC/MC对大环内酯类抗生素进行检测，如表2所示.

表2 LC-MC/MC法检测大环内酯类抗生素的国家标准

四级杆法是通过对被测样品离子的荷质比的测定来进行分析的一种方法.与普通质谱法相比，多重四级杆法和离子阱等能够直接对被测离子进行二级分析，并对被测样品进行定性定量分析.无需通过多次质谱串联即可达到准备分析样品的目的，改进后的四级杆法能够对更大规模的样品进行检测.由此可知，液相色谱法及其联用技术是目前测定大环内酯类抗生素最常见的方法，通过不同技术的联用，仪器分析法能够以高灵敏度、高效率、准确地完成对样品的检测，同时能够进行对复杂样品的分析，满足了在各种介质中对该类抗生素的检测.但该过程需要大型仪器，检测成本较高.相对于以免疫学为基础的快速检测法，检测速度较慢，但精度和准确度较高.

2.2 免疫层析快速检测技术

免疫层析法是目前常用的抗生素检测方法之一.其对抗生素的检测原理是设计出的抗生素抗原和相应的抗体，通过抗原和抗体的特异性结合来实现的.将免疫层析法应用进测试纸条中，通常利用纳米材料显色效果来显示检测结果，根据检测区域的信号变化对抗生素进行定性定量分析[29].在检测过程中无需对样品进行前处理.该方法具有检测速度快、成本低、携带方便等优点，能够满足牛奶、肉制品中抗生素残留的检测需求[30].目前，免疫层析法作为国家检测抗生素的标准方法之一，证明该方法在检测不同环境介质中的抗生素残余有较好的发展前景.

随着对免疫层析法的不断改进，纳米标记材料也在不断改进.根据抗体标记材料和作用原理不同分为酶联免疫吸附检测、胶体金免疫层析检测法、荧光微球免疫层析法.

酶联免疫吸附检测是将酶作为抗体标记材料的检测方法，能够简单快速地对某一部分抗生素进行检测.但由于在检测中不同抗生素之间抗体识别具有交互性，会导致结果的准确性受到影响而不能应用于复杂样品的检测中.韩青等[31]建立了一种通过酶联免疫吸附检测法测定牛奶中替米考星的方法，该方法的回收率最高达到90.1%以上，且该方法对泰乐霉素、红霉素等其他大环内酯类抗生素的交叉率较低，说明该方法能够对替米考星进行特异性识别.姚婵媛等[32]对牛奶中泰乐菌素进行检测，检出限为0.07ng/mL，回收率最低为78.4%，该方法能够对泰乐菌素进行高效准确的鉴定.胶体金免疫层析法使用的标记材料是目前最常见的纳米金材料，能够稳定地发出信号，但灵敏性和准确性较其他检测方法略差.吴广等[33]通过制备一种胶体金材料对食物中的甲基阿维菌素进行测定，其制备的胶体金材料具有良好的传信能力，在常温情况下能够保持较长时间的稳定性和良好的检测性能，并具有较高的灵敏度，这为该材料投入市场提供了理论依据.张春国[34]采用具有正电荷的纳米金对阿维菌素进行吸附检测，实验结果显示，加入金纳米离子能够降低检测限，同时减少检测时间，使检测更加便捷高效.赵福民等[35]对乳品中红霉素等抗生素进行测定，建立了多种抗生素共同检测的胶体金免疫检测体系.荧光微球免疫层析法是将部分镧系元素被聚合物材料包裹制备成的荧光微球作为标记材料，具有较高的灵敏度和稳定性.张正英等[36]建立了一种荧光分析法检测牦牛肉中的阿维菌素残余，通过对荧光纸条制备的优化，实现了对阿维菌素等多种大环内酯类抗生素的光谱检测.Anna等[37]利用侧向免疫法对母乳中大环内酯类抗生素进行检测，并通过改变乳胶粒子的性质来控制检测效果；Li等[38]建立了不同纳米探针和乳胶微球共同检测牛奶中的泰乐菌素，研究结果表明，三种探针对泰乐菌素的检测限为4～15μg，说明该方法具有较高的灵敏度.

2.3 微生物检测法

微生物检测法是通过抗生素对微生物生长抑制作用来进行检测的.将被测样品放入含有嗜热脂肪芽胞杆菌(Bacillusstearothermophilus)等指示菌的培养皿中，通过培养一定时间后嗜热脂肪芽胞杆菌的生长情况对抗生素的含量进行测定，在培养基中加入4%的TTC或pH指示剂用于检测显示.该方法已被作为鲜乳中抗生素残留的检测标准，主要是对青霉素类和氨基糖苷类抗生素检测，其中庆大霉素的检测限为30μg/L，具有较低的检测限和较高的灵敏度.该方法具有低成本、操作简便、适用范围广的特点，在对抗生素进行简易测定时常被使用.王珂[39]通过改变测验菌株、培养温度、培养基原料等，得到检测抗生素残余的最佳方法，使替米考星的检测限降低至0.1875μg/ml;王温琪等[40]通过有益菌作为检测指示菌，探讨了几种微生物对牛奶中红霉素等抗生素检测能力的影响.由于大环内酯类抗生素为广谱抗生素，对大部分微生物菌株均有抑制作用，因此在指示菌上有更大的选择空间，可选择具有良好指示效果的菌株或无二次污染的非致病菌.微生物检测法能够对多数环境介质中抗生素残余进行检测，但由于微生物培养过程中外界条件和微生物生长的不确定性，其检测结果精确度较仪器分析法和免疫快速检测法低，易与多项抗生素发生交叉影响，灵敏度较低.微生物检测法可与仪器分析法或免疫检测法联用，先通过微生物检测法对被测样品中所含抗生素进行简单分析，继而通过LC-MS法或ELISA法进行准确测定，能够通过多种技术联用得到更准确的检测结果.

2.4 电化学分析法

电化学分析法是近年来研发的抗生素检测技术，由于其具有操作简便、成本较低、稳定性好、灵敏度高的优点，从而在医疗、环境等领域中广泛应用.电化学分析法的检测原理是通过电化学传感器对样品中抗生素进行检测，即通过样品与传感器形成电池，通过对电极发生的氧化还原反应产物及电流、电势等物理量进行分析，确定抗生素的种类及含量.对传感器的检测功能起重要作用的是传感界面的介质，即构成传感器的纳米材料.适用于传感器的纳米材料需具有导电性能强、稳定性高、较大的表面积和良好的生物相容性.目前常用的纳米材料有碳纳米材料、金属离子纳米材料、碳基纳米材料等.Olga[41]设计出一种经金纳米粒子修饰过的碳棒作为电极材料，通过伏安法检测AZI、ROX含量，研究结果表明大环内酯类抗生素的检测限为0.045～1.43g/mL,相对标准偏差低于6%，说明该方法有较高的灵敏度和良好的可重复性；张凯鑫[42]设备出一种新型碳纳米复合材料GO-MWCNTs对大环内酯类抗生素进行检测，通过实验得到其在电化学分析中对阿奇霉素进行检测具有良好的电化学性能和检测能力.因此对传感器的界面及电极材料进行改进是电化学分析法不断改良的重要手段.

为改进电化学分析法，采用仿生电化学分析、光电化学分析法等新型方法来对抗生素进行检测.仿生电化学分析是通过将生物信号转换为电信号以得到检测结果的分析方法，该方法将抗体、酶、核酸等作为受体，当抗生素与其结合后会产生生物信号，不同抗生素的结构会使生物信号的强度发生变化，从而达到定性定量分析的目的.该方法较普通化学分析法更加简单，具有较高的特异性，能够完成更复杂样品的检测，同时具有更优良的生物相容性，在生物的内外环境检测中有巨大的发展前景.loan[43]设计了一种基于分子聚合物的简单仿生电化学法，对血浆、泪液中的阿奇霉素进行检测，显示其具有较低的检测限，证明该传感器是检测阿奇霉素的良好工具.光电化学分析法是通过光敏材料将光信号转换为电信号从而显示对抗生素的检测量，这需要光敏材料具有优良的光电转化能力和较好的生物相容性.冯雅倩[44]制备了一种基于分子印迹法的光电传感器，实现了对药物和生物样本中阿奇霉素的特异性检测，不易受到其他抗生素的影响，说明光电传感器受到外界环境影响较小，适用范围更大.

2.5 毛细管电泳法

毛细管电泳法的原理是基于带电粒子在电场中形成的电泳现象，通过不同粒子在电场中的不同迁移速度对样品进行检测.该方法具有检测快速，成本低等优点.但由于大环内酯类抗生素结构中不含荧光基团，且紫外吸收弱，在检测时产生信号较弱，不利于检测显示.因此大环内酯类抗生素利用毛细管电泳法时常与其他检测技术联用，如与电化学法联用.杨玚等[45]通过毛细管电泳法和电化学法对鸡蛋、药片等多种基质中大环内酯类抗生素进行有效检测，该方法在7min内完成对被测样品的分离，检测快速，灵敏度高.洪月琴[46]通过分子印迹固相萃取进行样品前处理，采用场放大样品堆积胶束毛细管色谱法完成对牛奶中红霉素、罗红霉素等抗生素的检测，检出限最高为0.004 mg/L,回收率最低为72.8%，能够满足我国抗生素最大允许残留量标准.

近年来，毛细管电泳法又划分为电容耦合非接触电导检测毛细管电泳-C4D、场放大样品堆积毛细管法、微流控芯片法、固相萃取-胶束电动毛细管色谱法等.这些方法大多通过对样品进行富集以达到更好的检测结果.Le[47]通过C4D法对氨基糖苷类抗生素进行检测，卡那霉素等的最佳检测限为0.5 mg/L，研究结果显示C4D的灵敏度不高，但在高浓度的抗生素环境中能够充分发挥作用.杨士萱[48]通过富集法对水中的磺胺类抗生素检测，并对检测条件进行优化以得到最佳的检测条件，该方法提高了毛细管法的重复性，克服了低灵敏度的缺点.李兴华[49]通过固相萃取-胶束电动毛细管色谱法检测河水中的β-内酰胺类抗生素，通过不同纳米材料提取样品中内酰胺类抗生素，起到了富集的作用，使检测更加灵敏准确.由于大环内酯类抗生素难以直接通过毛细管法进行检测，因此，近年来对大环内酯类的电泳法检测方面的研究较少.为使该方法能够对大环内酯类抗生素进行检测，须对该方法持续改进.

3 结论

大环内酯类抗生素作为一类高效的医疗药物及畜牧药物被广泛使用,由于其自身及代谢物所引发环境问题而逐渐受到限制.为使人们的安全得到保障，需要对各种环境介质中的大环内酯类抗生素进行快速灵敏的检测.传统的仪器分析法能够对土壤、水等环境中的抗生素进行有效的检测，仪器分析法主要通过液相色谱仪与多种检测仪器联用得到准确率高的检测结果，但前处理方法较复杂，多为大型仪器，检测成本高，不利于进行快速检测.免疫层快速检测技术能够对抗生素进行快速的检测，在食物的抗生素残留检测中有着广泛的应用，可对多种同类抗生素进行检测.但由于交互作用，无法对一种抗生素进行特异性检测.微生物检测法只能对部分介质中抗生素进行检测，且灵敏度不高，仅用于初次检测抗生素含量，但成本低，操作简单.电化学分析法能够快速检测，且灵敏度高，但对材料的电化学性能要求较高，为进一步提高该方法的可靠性，可研究新型纳米材料，以获得更好的检测效果.毛细管电泳法在抗生素检测中有良好的应用，但由于大环内酯类抗生素难以被检测出，需与其他检测技术联用，且近年来该方法对大环内酯类抗生素的研究较少，因此急需解决此问题以促进该技术的发展.综上所述，在对环境中的大环内酯类抗生素进行检测时，需根据介质、检测要求、预算等选择合适的检测方法.