黄芪及其活性成分的利水作用机制探讨*

赵安社，王新陆，朱明军，曹英杰，乔利杰，郑超楠

1.河南中医药大学第一附属医院，河南 郑州 450000；2.河南中医药大学，河南 郑州 450046

《中华人民共和国药典》记载：黄芪，甘、温，归肺、脾经，具有补气固表、利尿托毒、排脓、敛疮生肌之功效，中医古籍大多把它归为补益药中的补气药。黄芪具有利尿作用，防己黄芪汤、黄芪桂枝五物汤、桂枝加黄芪汤、黄芪芍药桂枝苦酒汤等方剂常用于治疗水肿，包括心源性水肿、肾病综合征水肿、黄斑水肿、脑水肿、外科手术水肿等[1-4]。通过分析名老中医医案，治疗水肿从“脾”论治，推测黄芪的功效为益气、健脾、补虚。《珍珠囊》载黄芪“甘温纯阳、补诸虚、益元气、活血生血”。《本经逢原》谓黄芪“性虽温补，而能通调血脉，流行经络”，说明黄芪非为纯补呆滞之品，而是以益气补虚之效，行通脉活血之用，对气虚血瘀之证而言，可谓两擅其功[5]。含黄芪的治疗水肿的方剂中，黄芪除了具有益气活血功效之外，是否同时具有利尿作用及发挥利尿作用的可能成分尚不清楚。基于此，本研究通过网络药理学及大鼠水负荷实验进行研究。

1 基于网络药理学研究黄芪治疗水肿的作用机制

1.1 资料与方法

1.1.1 药物活性成分及相关靶点的获取基于中药系统药理学数据库与分析平台(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)及PubChem数据库检索黄芪的化学成分，以口服生物利用度(oral availability，OB)≥30%、类药性(drug likeness，DL)≥0.18%为条件对化学成分进行筛选，得到黄芪的活性成分，并通过查阅文献进行补充。在PubChem数据库中获取黄芪活性成分的标准Smiles结构，导入Swiss Target Prediction数据库中对活性成分的作用靶点进行预测，并以Probability≥30%为条件进行筛选。利用TCMSP数据库获得黄芪活性成分的相关作用靶点，与Swiss Target Prediction数据库获得的作用靶点进行整合，通过Uniprot数据库对靶点进行标准化。

1.1.2 水肿相关靶点及黄芪治疗水肿的潜在靶点的获取在人类基因数据库(GeneCards)与人类孟德尔遗传数据库(online mendelian inheritance in man，OMIM)中以“edema”为关键词对疾病靶点进行预测，选取-IgP>5的靶点，并通过Uniprot数据库对靶点进行标准化。将黄芪活性成分的相关作用靶点与水肿相关疾病靶点导入Veney2.1软件进行映射，并绘制韦恩图，获取黄芪活性成分靶点与水肿相关靶点的共同靶点，即为黄芪治疗水肿的潜在靶点。

1.1.3 “活性成分-潜在靶点”网络构建将黄芪活性成分与潜在靶点导入Cytoscape 3.7.2软件，构建“活性成分-潜在靶点”相互作用网络。

1.1.4 蛋白质相互作用(protein-protein interaction，PPI)网络的构建将潜在靶点导入STRING数据库(https：//string-db.org/)中，物种设置为“Homo sapiens”，设置最低相互作用阈值≥0.90，并隐藏游离节点，构建PPI网络并筛选核心基因。

1.1.5 富集分析将黄芪治疗水肿的相关作用靶点导入DAVID数据库进行基因本体(gene ontology，GO)功能富集分析和京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路富集分析。

1.2 结果

1.2.1 药物活性成分及相关靶点基于TCMSP及PubChem数据库检索黄芪的化学成分，以OB≥30%、DL≥0.18%为条件对化学成分进行筛选后，共得到黄芪的活性成分20个。虽然黄芪皂苷Ⅰ、黄芪皂苷Ⅱ、黄芪皂苷Ⅲ、黄芪皂苷Ⅳ及甜菜碱的DL较低，但文献研究显示这些成分有明显的利尿作用，也纳入后续研究。将25个黄芪活性成分导入Swiss Target Prediction数据库获取相关靶点，并与TCMSP数据库中所得靶点合并，共获得248个黄芪活性成分作用靶点。见表1。

表1 黄芪活性成分信息表

1.2.2 水肿相关靶点及黄芪治疗水肿的潜在靶点检索Gene Cards数据库与OMIM数据库筛选出-IgP>5的靶点，共得到710个水肿相关靶点。将248个黄芪活性成分作用靶点与710个水肿相关靶点导入Veney2.1软件，绘制韦恩图，取交集，最终获得黄芪活性成分与水肿的共同作用靶点79个，即为黄芪治疗水肿的潜在靶点。见图1。

图1 “活性成分-疾病”靶点韦恩图

1.2.3 “活性成分-潜在靶点”网络将25个药物活性成分与79个潜在靶点导入Cytoscape3.7.2软件进行映射，构建“活性成分-潜在靶点”相互作用网络图。网络中圆形代表活性成分，方形代表潜在靶点，从图中可知，该网络共包括95个节点、175条边。因黄芪25个活性成分中有10个成分未找到与此对应的潜在作用靶点，因此图中只显示15个活性成分，其中对应靶点最多的成分为槲皮素、山柰酚、7-O-methylisomucronulatol、芒柄花素、毛蕊异黄酮。结合已报道的基础动物实验研究及网络药理学靶点数目及相关性，选取芒柄花素、毛蕊异黄酮进行后续实验验证研究。见图2。

图2 “活性成分-潜在靶点”网络图

1.2.4 PPI网络将79个黄芪治疗水肿的潜在靶点导入STRING数据库并进行分析，获得PPI网络图。此网络有79个节点、225条边，平均节点度值为5.7，其中节点表示靶点蛋白，边代表蛋白与蛋白之间相互作用关系，边数代表关联度的大小。富集P<1.0×10-16的靶点，平均度值为31.418，选取度值大于平均值的靶点为核心靶点，共41个，涉及蛋白激酶Bα(probein kinase Bα，AKT1)、丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPK)、肿瘤坏死因子(tumor necrotic factor，TNF)、磷脂酰肌醇-3-激酶催化亚基α(phosphatidylinositol 3 kinase adaptor，PIK3CA)等。见图3。

图3 黄芪利水作用核心靶点网络图

1.2.5 GO功能富集分析将79 个潜在靶点导入DAVID数据库进行GO功能富集分析，包括生物过程(biological process，BP)、分子功能(molecular function，MF)和细胞组分(cellular component，CC)3 个分支。设定阈值P<0.05，共富集到生物过程464个条目，涉及NO生物合成过程的正调控、炎症、凋亡、雌二醇、应对缺氧、RNA聚合酶II启动子转录的正调控等；细胞组分45个条目，涉及细胞膜、细胞质、线粒体、受体复合物、细胞外基质等；分子功能77个条目，涉及细胞因子活性、蛋白结合、酶结合、serine-type肽链内切酶活性、血红素结合、生长因子活性、蛋白同二聚活动等。筛选排名前10位的生物过程、分子功能和细胞组分，用GraphPad Prism 5.0绘图。见图4。

图4 GO功能富集分析

1.2.6 KEGG通路富集分析对筛选得到的 79 个关键靶点进行KEGG 通路富集分析，设定阈值P<0.05，共富集得到106条通路，主要涉及TNF 信号通路(16个靶点)、低氧诱导因子-1(hypoxia-inducible factor-1，HIF-1)信号通路(13个靶点)、磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)-AKT信号通路(20个靶点)、叉头状转录因子(forkhead transcription factor，FoxO)信号通路(12个靶点)、p53信号通路(9个靶点)、鞘脂(sphingolipid)信号通路(11个靶点)、T细胞受体(T cell receptor)信号通路(10个靶点)等。说明黄芪主要活性成分的作用靶点分布在不同的代谢通路，多成分、多靶点相互调节是黄芪治疗水肿的可能作用机制。选择前20条信号通络通过Omicshare软件制作高级气泡图。见图5。

图5 KEGG通路富集分析

2 黄芪及其活性成分的利水作用研究

2.1 材料

2.1.1 动物54只6～8周龄SPF级SD雄性大鼠，体质量(200±20)g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，动物许可证编号：SCXK(京)2015-0005。动物每笼4只，饲养在22 ℃、40%湿度的环境下，自由饮食进水。本研究通过河南中医药大学第一附属医院伦理委员会批准(伦理批号：YFYDW2020007)。

2.1.2 药物与试剂黄芪(北京同仁堂药店)；呋塞米片(江苏亚邦爱普森药业有限公司，国药准字：HB2021428)。芒柄花素、毛蕊异黄酮标准品(纯度≥98%，上海源叶生物科技有限公司，货号：B20836、B20847)。

2.1.3 仪器冯氏DXL-D型代谢笼(苏州冯氏实验动物设备有限公司)；Waterse26995型高效液相色谱仪、2998型紫外检测器、Empower化学工作站(美国沃特世公司)；Alltech 2000ES型蒸发光散射检测器(美国奥泰公司)；CF225D型电子天平(德国赛多利斯集团)。

2.2 方法

2.2.1 药物制备100 g黄芪经清洗、去除杂质、烘干后质量共计81.3 g。加10倍量水煎煮三次，每次1 h，合并煎煮液，滤过，滤液减压浓缩得冻干粉26.33 g，使用时用超纯水进行配制。

2.2.2 HPLC测定浸膏中毛蕊异黄酮和芒柄花素含量适量浸膏粉末过四号筛后，精密称取0.2 g，置具塞锥形瓶中，加入含4%浓氨试液的80%甲醇溶液50 mL，超声30 min，用含4%浓氨试液的80%甲醇溶液补足失重，摇匀，过滤，精密量取续滤液 25 mL，蒸干后用80%甲醇溶解，转移至5ml量瓶中，加80%甲醇至刻度，摇匀，过滤，取续滤液进行检测。检测波长260 nm，以AB=乙腈0.3%甲酸水溶液为流动相，梯度洗脱。洗脱程序为0～20 min，10%～30% A；20～25 min，30% A；25～35 min 30%～60%A。毛蕊异黄酮与芒柄花素分离度良好。外标曲线法计算样品中毛蕊异黄酮和芒柄花素含量[6]。

2.2.3 水负荷实验大鼠水负荷实验相关方法参照2000年人民卫生出版社出版的《中药药理研究方法学》。将大鼠置于代谢笼中适应性喂养48 h后，禁食不禁水18 h，称质量，按照50 mL·kg-1的剂量灌胃给予生理盐水，进行水负荷实验。30 min后，按摩腹部排空膀胱尿液，将54只大鼠随机分为正常组、黄芪小剂量组、黄芪大剂量组、芒柄花素组、毛蕊异黄酮组、呋塞米组，每组9只。依照黄芪相关方剂临床常用剂量，结合前期预实验，黄芪剂量分为 60 g、30 g两个剂量，根据人与大鼠体表面积进行换算，黄芪大、小剂量组大鼠的给药剂量分别为 2.3 g·kg-1及1.15 g·kg-1。芒柄花素组、毛蕊异黄酮组的灌胃剂量根据浸膏中毛蕊异黄酮和芒柄花素的含量进行计算。选择呋塞米作为阳性对照药，经换算后给药剂量为4.6 mg·kg-1。按照 10 mL·kg-1的剂量灌胃给予相应实验用药，正常组灌入同等容积的生理盐水，分别收集灌胃后0～2 h、2～4 h、4～6 h、7～24 h内的大鼠尿液，共进行3次实验，每次每组3只大鼠，取平均值作为实验结果。

2.3 结果

2.3.1 浸膏中芒柄花素和毛蕊异黄酮含量结果显示，芒柄花素的含量为5 545.674 μg·g-1，毛蕊异黄酮的含量为39.66 μg·g-1。根据高效液相的检测结果计算得出，芒柄花素和毛蕊异黄酮组大鼠的灌胃剂量分别为9.2 mg·L-1、1.3 g·L-1。见图6。

图6 黄芪样品中芒柄花素、毛蕊异黄酮含量检测色谱图

2.3.2 黄芪及芒柄花素、毛蕊异黄酮的利水作用与正常组比较，灌胃后0～2 h、2～4 h及0～6 h内呋塞米组、黄芪小剂量组及毛蕊异黄酮组的尿量显著增多(P<0.05)；灌胃后4～6 h内呋塞米组、黄芪小剂量组、黄芪大剂量组及芒柄花素组的尿量显著增多(P<0.05)；灌胃后7～24 h内黄芪小剂量组、毛蕊异黄酮组大鼠的尿量明显增加(P<0.05)。提示黄芪小剂量、毛蕊异黄酮具有长效利尿的作用。见表2。

表2 黄芪及主要活性成分对大鼠尿量的影响

3 讨论

黄芪，豆科多年生草本植物蒙古黄芪或膜荚黄芪的干燥根，别名绵芪或绵黄芪，始载于《神农本草经》，“耆，长也。”黄耆色黄，为补药之长，故名黄耆，今俗作黄芪。以山西、内蒙古武川等地所称为北芪者，质地好，为正品。戴瑜婷等[6]指出黄芪具有补气升阳、固表止汗、利水消肿、生津养血、行滞通痹、托毒排脓、敛疮生肌等功效，临床用于治疗气虚乏力、纳差便溏、中气下陷、肢肿尿少、气虚血滞、痹痛麻木等。古代医家常用黄芪配伍不同中药治疗虚劳、血痹、历节病、黄汗、黄疸、表虚不固之风水或风湿痹证等[7]。医圣张仲景在《金匮要略·痉湿暍病脉证并治》云：“风湿，脉浮身重，汗出恶风者，防己黄芪汤主之。”治表虚湿痹证，取防己黄芪汤，以黄芪 30 g 配伍防己 15 g，固表祛风以行水，常加土茯苓、豨莶草利水渗湿，忍冬藤、青风藤、海桐皮祛风利湿[7]。王暴魁教授参考《冷庐医话》治疗水肿案中黄芪的用量(四两)及补阳还五汤中黄芪的用量(四两)，并结合自己的临床经验，主张采用大剂量生黄芪治疗水肿及蛋白尿，并根据病情轻重、患者体质量、患者服用后的反应等调整用量[8]。黄煌指出：“黄芪主治汗出而肿[9]。”自汗皮水、风湿身重者用黄芪，以其利水[10]。

水肿是内科常见病，指体内水液滞留，泛溢肌肤，以眼睑、头面、四肢、腹背甚至全身浮肿为特征，《黄帝内经》中水肿病名众多，包括肾风、风水、水肿、溢饮、石水、涌水等，主要病机为脏腑功能失调致阳气阻遏，气化失司，聚水为水肿[11]。《素问·汤液醪醴论》云：“去宛陈莝，微动四极，温衣，缪刺其处，以复其形；开鬼门，洁净府……[12]”提出水肿的治疗有“开鬼门”“洁净府”“去菀陈莝”三条基本原则，即发汗，利小便，攻下逐水、通利大便。张志聪谓积者谓之宛，久者谓之陈，宛陈谓之积久之水邪，茎谓之杂草，二者喻指体内积久水邪与久病疲血，“去宛陈莝”指的就是去除体内积久痕滞之物[13]。朱丽颖等总结了《金匮要略》中关于四水的症状及治疗用方，将四水治疗方剂分为以防己黄芪汤与越婢汤为代表方剂的两类，方为纲体现出从肺论治及从脾论治两大治疗体系[14]。现代医学认为，引起水肿的主要原因为血管内外液体交换平衡失衡及体内外液体交换平衡失衡，水钠潴留是引起体内外液体交换平衡失衡的主要原因，心房钠尿肽(atrial natriuretic peptide，ANP)分泌减少及肾小管对ANP的利尿作用抵抗，血管加压素(arginine vasopressin，AVP)或抗利尿激素(antidiuretic hormone，ADH)分泌增加、醛固酮分泌增多等，均可引起肾小球滤过率下降、肾小管对水钠重吸收增加，引起水钠潴留，最终导致水肿[15-18]。

针对水肿患者，除积极治疗原发病之外，服用利尿剂是最常用的治疗方法，也往往能够起到立竿见影的效果，但对于一些慢性疾病，尤其是心源性疾病引起的水肿，需长期服用利尿剂，以改善水钠潴留、缓解心衰症状、延缓心衰进展，但利尿剂抵抗是不能忽视的一个问题，有研究显示，约有1/3的心衰患者存在利尿剂抵抗的问题[19]，目前常用的利尿剂，包括袢利尿药、噻嗪类利尿药和保钾利尿药三类，其中袢利尿药效果最强，有明显的“剂量-效应”关系，作用靶点相对单一，利尿效果明显，临床应用广泛。但长期服用利尿剂，不仅会引起电解质紊乱，利尿效果逐渐减弱也是不争的事实，同时会引起口干而增加饮水次数，继而引起严重钠潴留，再次形成引发水肿的机体内环境[20]。

中药成分复杂，多种成分多途径、多靶点共同发挥作用，能很好地解决单一靶点抵抗问题，并已广泛应用于临床，但同时多种成分的交互作用、靶点的相互关联，也给研究带来了一定的困难。网络药理学是建立在疾病、基因、靶点与药物相互作用的网络模型表达基础上，通过网络分析系统地观察药物对疾病网络的影响，从而揭示多分子药物协同作用的新学科，具有整体、协同和动态的特点[21]，这一特点与中医学“整体观”和“辨证施治”的观点不谋而合。针对确定中药及中药复方活性成分、中医症候的研究，阐明配伍规律、解释方剂-症候关系和复方优化寻找新药等方面具有一定优势[22-23]。

现代研究发现，黄芪的主要成分包括皂苷类(黄芪皂苷甲、乙、丙等)、黄酮类(芒柄花素，毛蕊异黄酮，3-羟基-9，10-二甲氧基紫檀烷等)、氨基酸类(8-氨基丁酸、天冬酰胺等)、多糖类(鼠李糖、蔗糖、葡萄糖醛酸等)以及胆碱、香菜碱、香豆素等[24]。研究表明，黄芪利水作用功效可能与调节水与电解质平衡、调控水通道蛋白、保护肾脏微组织结构、修复黏膜损伤、纠正肠道菌群微生态动态平衡等作用有密切联系[25]。汪贤聪等研究发现黄芪通过显著改善肾病综合征患者精氨酸AVP系统提高肾小球滤过率，进而实现其利尿作用[26]。张永娜等[27]研究发现黄芪注射液可明显促进水负荷模型大鼠尿液中Na+、Cl-的排泄，未发现黄芪注射液对尿液中K+的排泄与尿液pH值有影响。

本研究通过TCMSP数据库、PubChem数据库以OB≥30%、DL≥0.18%为条件，筛选出黄芪共20个活性成分，结合文献查阅，共得到25个活性成分。通过Veney2.1软件获取79个黄芪药物成分与水肿共同作用靶点，涉及的活性成分共14个，涉及最多的成分为黄酮类(芒柄花素、毛蕊异黄酮、檞皮素、异鼠李素、二氢异黄酮、山柰酚)、皂苷类(常春藤皂苷元、甜菜碱)、氨基酸类(叶酸)，靶点最多、相关度最高的为黄酮类，主要为槲皮素、7-O-methylisomucronulatol、山柰酚、芒柄花素、毛蕊异黄酮。结合文献研究、网络药理学靶点数目及相关性，本研究选取刺芒柄花素、毛蕊异黄酮进行后续实验验证研究。

通过大鼠水负荷实验证实，黄芪小剂量具有明显的利尿作用，利尿强度弱于呋塞米片，但作用持久，持续观察24 h发现，前6 h呋塞米组尿量明显增加，7～24 h尿量增加不明显；黄芪小剂量组0～6 h、7～24 h两个时间段尿量均增加，且较正常组具有统计学意义。黄芪大剂量组前6 h尿量明显减少，且尿液颜色明显变黄，7～24 h尿量与正常组相当。毛蕊异黄酮组、芒柄花素组0～6 h、7～24 h 两个时间段尿量均增加，毛蕊异黄酮组尿量增加更明显且具有统计学意义。此研究证实，黄芪具有利尿作用，并且与剂量有关系，黄芪30 g利尿作用明显，黄芪60 g尿量较正常组减少，主要利尿作用可能与毛蕊异黄酮、芒柄花素相关，需进一步研究证实。雷根平受《冷庐医话》中“芪米汤”一案启发，经临床多年实践发现，对于各种原因引起的水肿，凡属气虚，仅重用黄芪一味即可达到利尿功效，此功效需用量在 90 g 以上方能见明显疗效。视水肿之严重程度，大剂量可用至100～200 g，超大剂量可至300 g，称之为“独芪汤”[28]。现代患者大多以慢性病为主，病情周期长，加之大多药物采用人工种植，药力较古时相差较大；且患者期望值亦普遍较高[29]。“中医不传之秘在于量”，因此有关剂量的应用还需进一步研究，找到黄芪最佳利尿效果的使用剂量。

通过KEGG通路富集分析及GO功能富集分析发现，生物过程涉及NO生物合成过程的正调控、炎症、凋亡、雌二醇、应对缺氧、RNA聚合酶II启动子转录的正调控等；细胞组分涉及细胞膜、细胞质、线粒体、受体复合物、细胞外基质等；细胞组分涉及细胞因子活性、蛋白结合、酶结合、serine-type肽链内切酶活性、血红素结合、生长因子活性、蛋白同二聚活动等方面。黄芪抗水肿靶点主要涉及TNF信号通路、HIF-1、PI3K-Akt信号通路、FoxO 信号通路、p53信号通路、Sphingolipid信号通路、T cell receptor等信号通路。水肿是多种疾病的并发症状，包括心力衰竭、肾功能不全、风湿免疫相关疾病等。《素问·经脉别论》中“饮入于胃，游缢精气，上输于脾，脾气散精，上归于肺，通调水道，下输膀胱，水精四布，五经并行”。《素向·水热穴论》之水肿形成“其本在肾，其末在肺”的论述，体内水液的运行依靠肺气的通调、脾气的转输、肾气的开阖及膀胱的气化，因而小便通利。相关研究已证明，PI3K-AKT信号通路、FoxO 信号通路、p53信号通路、Sphingolipid信号通路、T cell receptor等信号通路与肺、脾、肾、心生理功能及相关疾病的发生发展密切相关，也间接说明黄芪利水消肿功效与调节整体身体机能有关。

本研究通过网络药理学初步聚焦了黄芪的主要作用成分、可能涉及的生物学过程及作用靶点。通过大鼠水负荷实验，初步证实了黄芪具有利尿作用，且与黄酮类成分密切相关；但对于心衰、肾病综合征引起的水肿，黄芪是否具有同样的利尿效果，涉及的生物学过程及作用通路、作用靶点是否一致，仍需结合蛋白组学、代谢组学等相关研究方法进一步明确。