藏药十五味赛尔斗丸治疗豚鼠胆囊炎的作用机制研究*

陈蔚，马腾飞，武慧超，2，刘媛媛，仁青东主，张金魁，任小巧，2

1.北京中医药大学，北京 100029；2.北京中医药大学民族医药学研究所，北京 100029；3.青海大学，青海 西宁 810016；4.青海藏医药研究院，青海 西宁 810016

胆囊炎(cholecystitis)是指胆囊壁的炎症反应，是临床常见和多发的胆系疾病，常由胆囊管梗阻、细菌感染、化学性刺激、高脂饮食等所诱发的炎性病变所致[1]。根据发病缓急和经过可分为急性胆囊炎和慢性胆囊炎；根据是否伴有结石可分为结石性胆囊炎和非结石性胆囊炎。藏药十五味赛尔斗丸具有解热镇痛、抑菌、消炎、消肿、利胆溶石、排石，提高机体免疫功能等作用，临床用于治疗胆囊炎、胆囊结石、胆总管结石及肝内胆管结石[2]，但其作用机制及有效成分尚不清楚。鉴于此，本研究基于系统生物学理论，通过网络药理学的方法结合分子对接技术对治疗的关键靶点、通路进行预测，分析其潜在作用机制，然后应用动物模型实验验证预测出的核心靶点和通路，多角度分析藏药十五味赛尔斗丸治疗胆囊炎的作用机制。

1 基于网络药理学研究十五味赛尔斗丸治疗胆囊炎的作用机制

1.1 资料与方法

1.1.1 十五味赛尔斗丸活性成分的获取及相关靶点预测通过检索PubMed(https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)、CNKI、万方、维普等文献数据库，结合中药系统药理学数据库与分析平台(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)、中药分子机制的生物信息学分析工具(bioinformatics analysis tool for molecular mechanism of traditional Chinese medicine，BATMAN-TCM)等数据库，搜集十五味赛尔斗丸各药的化学成分。将获取的化学成分在PubChem数据库中下载SDF格式文件，逐一上传至SwissADME(http：//swissadme.ch/)进行活性成分筛选。满足肠胃吸收(gatrointestinal absortion)为“High”，且5种类药性(lipinski、ghose、veber、egan、muegge)结果中有2个及2个以上为“Yes”的成分视为活性成分。再通过蛋白质数据库Swiss Target Prediction(http：//www.swisstargetprediction.ch/)筛选出活性成分的对应靶点，整理并去重后作为十五味赛尔斗丸活性成分的靶点，以供后续分析。

1.1.2 胆囊炎相关靶点预测及十五味赛尔斗丸治疗胆囊炎的潜在靶点获取在人类基因数据库(GenCards，https：//www.genecards.org)、在线人类孟德尔遗传数据库(Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM，https：//omim.org)中以 cholecystitis、chronic cholecystitis、acute cholecystitis、gallstones和cholelithiasis为关键词进行检索，获得胆囊炎相关的疾病靶点。将十五味赛尔斗丸有效成分的相关靶点与胆囊炎相关靶点进行映射，绘制venny图，所得交集靶点即为十五味赛尔斗丸治疗胆囊炎的潜在靶点。

1.1.3 “药物-活性成分-潜在靶点-疾病”网络的构建将十五味赛尔斗丸治疗胆囊炎的潜在靶点、活性成分和疾病导入Cytoscape3.8.2软件，构建“药物-活性成分-潜在靶点-疾病”网络图，并通过“Network Analyzer”进行网络拓扑分析，筛选十五味赛尔斗丸治疗胆囊炎的关键成分。

1.1.4 蛋白质相互作用(protein-protein interaction，PPI)网络的构建将潜在靶点输入STRING数据库(https：//www.string-db.org/)，以“Homo sapiens”为分析条件，设置置信度蛋白质参数>0.9，去除散在靶点，得出蛋白质相互作用网络关系，导入Cytoscape3.8.2软件中进行可视化处理，获得PPI网络。通过网络拓扑分析获得核心靶点。

1.1.5 富集分析将潜在靶点导入DAVID数据库(https：//David.ncifcrf.gov/summary.jsp)进行基因本体(gene ontology，GO)功能富集分析和京都基因与基因组百科全书(kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路富集分析，以P≤0.5为条件进行筛选并排序，选择排名前20的条目，运用微生信(http：//www.bioinformatics.com.cn/)在线作图工具作出气泡图。

1.1.6 分子对接通过PubChem数据库获得十五味赛尔斗丸治疗胆囊炎的关键成分的分子结构，利用Chem3D进行格式转化及能量最小化，将所得结构导入Schrödinger软件建立数据库，通过加氢、结构优化、能量最小化后作为分子对接的配体分子数据库。通过蛋白质数据库(https：//www.rcsb.org/)获得靶点蛋白的晶体结构，导入Maestro11.9平台，用Schrödinger的Protein Preparation Wizard模块对蛋白进行去除结晶水、补加缺失的氢原子、修复缺失键信息、修补缺失肽段处理，最后通过OPLS3e力场对蛋白进行约束能量最小化以及几何结构的优化，并保存为受体。采用Schrödinger Maestro软件中的Glide模块进行分子对接。选取蛋白的原配体或者预测活性位点作为12 Å盒子的质心，最后通过标准方法(standard precision，SP)完成分子对接及筛选，采用Pymol2.1进行可视化分析。

1.2 结果

1.2.1 十五味赛尔斗丸活性成分及相关靶点通过筛选与整理，十五味赛尔斗丸组方的15味中药中纳入12味中药，分别为印度獐牙菜(8)、小檗皮(5)、角茴香(35)、波棱瓜子(16)、榜嘎(11)、兔耳草(8)、五灵脂(75)、石榴子(4)、金腰草(4)、诃子(9)、川木香(12)、矮丛凤毛菊(6)，满足要求的活性成分193个。经Swiss Target Prediction数据库获取 1 069 个活性成分相关靶点。见表1。

表1 十五味赛尔斗丸部分活性成分信息

1.2.2 胆囊炎相关靶点及十五味赛尔斗丸治疗胆囊炎的潜在靶点在GenCards数据库、OMIM数据库检索胆囊炎相关的疾病靶点，去重后共得到胆囊炎相关靶点702个。将十五味赛尔斗丸有效成分的相关靶点与胆囊炎相关靶点进行映射，绘制venny图，获得141个交集靶点，即为十五味赛尔斗丸治疗胆囊炎的潜在靶点。见图1。

图1 交集靶点韦恩图

1.2.3 “药物-活性成分-潜在靶点-疾病”网络将十五味赛尔斗丸治疗胆囊炎的潜在靶点、活性成分和疾病导入Cytoscape3.8.2软件，获得“药物-活性成分-潜在靶点-疾病”网络图。该网络中包含338个节点(node)和2 166条边(edge)。通过“Network Analyzer”进行网络拓扑分析，筛选出4个度值(degree)大于2倍平均值、介数中心性(betweenness centrality，BC)大于平均值的活性成分，即十五味赛尔斗丸治疗胆囊炎的关键成分，分别是N-methylcorydaldine、氧化血根碱、金圣草(黄)素和7-羟基香豆素。见表2，图2。

表2 十五味赛尔斗丸治疗胆囊炎的关键成分拓扑参数

图2 “药物-活性成分-潜在靶点-疾病”网络

1.2.4 PPI网络及核心靶点将141个潜在靶点输入STRING数据库，得出蛋白质相互作用网络关系，导入Cytoscape3.8.2软件中获得PPI网络。该网络中节点越大，颜色越深，则度值越大。网络拓扑分析，根据degree、BC、接近中心性(closeness centrality，CC)、集聚系数(clustering coefficient)及节点邻居的平均连接度(neighborhood connectivity，NC)筛选出degree、BC均大于平均值的靶点，即为十五味赛尔斗丸治疗胆囊炎的核心靶点，共30个。排名前20位的核心靶点包括磷脂酰肌醇-3-激酶催化亚基α(phosphatidylinositol-4，5-bisphosphate 3-kinase catalytic subunit alpha，PIK3CA)、丝裂原活化蛋白激酶1(mitogen-activated protein kinase1，MAPK1)、MAPK3、肿瘤蛋白53(tumor protein 53，TP53)、蛋白激酶B(protein kinase1，AKT1)、表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)、Harvey-RAS(HRAS)、血管内皮生长因子A(vascular endothelial growth factor A，VEGFA)、凝血因子Ⅱ(coagulation factor II，F2)、雌激素受体1(estrogen receptor，ESR1)、白细胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、IL-8(CXCL8)、缓激肽受体B2(recombinant bradykinin receptor B2，BDKRB2)、BDKRB1、Janus激酶2(Janus kinase 2，JAK2)、1-磷酸鞘氨醇受体1(sphingosine 1-phosphate receptor 1，S1PR1)、发动蛋白1(dynamin 1，DNM1)、组蛋白去乙酰化酶1(histone deacetylase 1，HDAC1)、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)、基质金属蛋白酶-9(matrix metallopeptidase-9，MMP-9)。见图3、图4及表3。

图3 PPI网络

表3 排名前20位的核心靶点拓扑参数

图4 核心靶点PPI网络

1.2.5 富集分析将潜在靶点导入DAVID数据库进行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析。GO富集分析共得到661个条目，其中包含生物过程(biological process，BP)491个，细胞组分(cellular component，CC)62个，分子功能(molecular function，MF)108个。生物过程主要涉及对缺氧的反应(response to hypoxia)、蛋白质磷酸化的正调控(positive regulation of protein phosphorylation)、对脂多糖的反应(response to lipopolysaccharide)等。细胞组分主要涉及质膜(plasma membrane)、细胞外间隙(extracellular space)、细胞表面(cell surface)、小窝(caveola)等。分子功能主要涉及酶结合(enzyme binding)、血红素结合(heme binding)、氧结合(oxygen binding)、类固醇激素受体活性(steroid hormone receptor activity)、RNA 聚合酶 II 转录因子活性(RNA polymerase II transcription factor activity)、配体激活的序列特异性 DNA 结合(ligand-activated sequence-specific DNA binding)等。KEGG通路富集分析共得到113条通路，主要涉及缺氧诱导因子1(hypoxia-inducible factor-1，HIF-1)信号通路、催乳素(prolactin)信号通路、甲状腺激素(thyroid hormone)信号通路、TNF信号通路等。见图5、图6。

图5 GO功能富集分析气泡图

图6 KEGG信号通路分析气泡图

1.2.6 分子对接以N-methylcorydaldine、氧化血根碱、金圣草(黄)素及7-羟基香豆素为配体分子，以PIK3CA、TNF、IL-6、EGFR、AKT1为受体进行分子对接。结果显示，结合能均小于-6 kcal·mol-1，提示核心活性成分与关键靶点具有较高的匹配度和较好的结合活性，其中各化合物与TNF的结合能最低。见表4，图7。

表4 分子对接结果

图7 分子对接结果

2 基于NF-kB通路研究十五味赛尔斗丸治疗胆囊炎的作用机制

2.1 材料

2.1.1 动物60只雌雄各半清洁级豚鼠，体质量(350±50) g，由北京艾尼特科技有限公司提供，实验动物许可证号：SCXK(京) 2016-0007。实验动物分笼饲养于北京中医药大学动物房，室温维持在(25±1)℃，湿度维持在(65±5)%，12 h循环交替光照(光照时间为730到1930)，控制干扰噪音及光线。在开始实验前，动物适应性饲养1周，采用普通动物饲料+蔬菜(大白菜、娃娃菜、小青菜和生菜)或维生素C，自由饮食、饮水。实验操作符合实验动物伦理学的相关规定，所有实验豚鼠的给药、灌胃、喂养等严格遵照实验动物伦理协会规定的动物伦理福利条款。实验经北京中医药大学医学与实验动物伦理委员会审查通过，动物伦理审查编号：BUCM-4-202012100202-4120。

2.1.2 药物与试剂十五味赛尔斗丸(青海久美藏药药业有限公司，批号：20200701)；盐酸林克霉素(上海旭东海普药业有限公司，批号：AM191006)；消炎利胆片(广东罗浮山国药有限公司，批号：F20A005)；总RNA提取试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒(北京索莱宝科技有限公司，货号：R1200、PC0020)；通用逆转录试剂盒、实时荧光定量PCR试剂盒(上海翊圣生物科技有限公司，货号：11141ES60、11201ES08)；核转录因子kappa-B(nuclear factor kappa-B，NF-κB)p65 抗体(美国proteintech公司，货号：10745-1-AP)；羊抗兔HRP二抗(北京博奥森生物技术有限公司，货号：bs-0295G-HRP)；TNF-α ELISA试剂盒(江莱生物技术有限公司，货号：JL13090)；引物序列在上海晶莱生物技术有限公司北京晶莱生物实验室设计，并由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

2.1.3 仪器3120000259型2～200 μL精密移液器(德国Eppendorf公司)；Synergy H4型酶标仪(美国Biotek公司)；ST-36WT型洗板机(上海科华实验系统有限公司)；HDPN-88型电热恒温培养箱(上海跃进医疗器械有限公司)；80-2型台式低速离心机(离心半径：10 cm，上海医疗器械技术有限公司)；Genesy 98T型普通PCR仪(西安天隆科技有限公司)；MA-6000型实时荧光定量PCR仪、MA-6000型核酸检测仪(苏州雅睿生物技术股份有限公司)、BSH-C2型组织破碎仪(杭州遂真生物技术有限公司)；5200型全自动化学发光图像分析系统(上海天能科技有限公司)；1645070型电泳仪、BE6085型电转仪(美国Bio-rad公司)。

2.2 方法

2.2.1 药物制备十五味赛尔斗丸醇提物的制备：用电子天平准确称量十五味赛尔斗丸300 g，碾碎后加入10倍量 70%乙醇，回流提取1 h后，将提取液移置于旋转蒸发仪中加热旋蒸，温度为60～70 ℃，当药液体积为0.5～1 L时，倒出并放置于水浴锅中蒸干，再放置于真空干燥箱里面干燥，所得浸膏冷冻干燥后粉碎，使用时用生理盐水配置；十五味赛尔斗丸水溶液和消炎利胆片溶液的制备：十五味赛尔斗丸丸剂及消炎利胆片使用时分别研成粉末，按照给药剂量溶于生理盐水。

2.2.2 胆囊炎模型制备、动物分组与给药随机从60只豚鼠中选12只为正常组，其余48只豚鼠皮下注射30 mg·kg-1盐酸林可霉素，每天1 次，连续7 d复制豚鼠胆囊炎模型。当造模豚鼠出现蜷缩，精神萎靡，进食减少，尿黄，体质量明显降低的现象；且病理检查发现胆囊形态改变，出现明显的炎症，胆汁浑浊，可见黑色的泥沙样结石等时视为模型建立成功。采用随机数字表法将造模成功的48只豚鼠随机分为模型组、十五味赛尔斗丸水溶液组、十五味赛尔斗丸醇提组、消炎利胆片组，每组12只。根据《实验动物学》不同动物间体表面积折算等效剂量系数表可知，体质量为70 kg的人与体质量为0.4 kg的豚鼠之间换算系数为0.031[3]，结合比率按公式计算本实验中豚鼠的用药剂量为：豚鼠的给药剂量=0.031×人的每日剂量4.5 g÷豚鼠体质量0.4 kg=0.35 g·kg-1，即十五味赛尔斗丸水溶液组的给药剂量为0.35 g·kg-1；由于十五味赛尔斗丸醇提物的成膏率为35%，十五味赛尔斗丸醇提组的给药剂量为0.12 g·kg-1；消炎利胆片组的给药剂量 0.36 g·kg-1；造模成功后，各给药组给予相应剂量的药物进行灌胃，正常组和模型组给予等体积的生理盐水，每天1次，连续15 d。

2.2.3 病理学检查末次给药后禁食禁水12 h，称量豚鼠的质量，按3.5 mL·kg-1剂量腹腔注射10%水合氯醛麻醉豚鼠，腹主动脉取血后，结扎胆囊管，摘胆囊抽取胆汁，将胆囊分为三份，取一份豚鼠胆囊标本，以10%甲醛固定24 h后换成新鲜的10%甲醛继续固定24 h。常规脱水、石蜡包埋，切片，HE 染色，显微镜下观察其病理学改变。

2.2.4 TNF-α含量的测定用ELISA法测定血清和胆汁样本中TNF-α的含量，在450 nm波长处检测各孔的OD值。在Excel工作表中，以标准品浓度作横坐标，对应OD值为纵坐标，绘制出标准品线性回归曲线，按曲线方程计算各样本浓度值。

2.2.5 实时荧光定量PCR检测胆囊中NF-κB、TNF-α的mRNA表达提取每只豚鼠胆囊组织总 RNA，采用通用逆转录试剂盒将RNA逆转录为cDNA后进行PCR反应。反应体系：5 μL cDNA、5 μL GoTaq反应液、0.5 μL上游引物、0.5 μL下游引物、20 μL无菌超纯水。将PCR 反应混合液置于7500 Real Time PCR System进行扩增，扩增程序：95 ℃ 预变性5 min，95 ℃变性10 s，60 ℃ 退火 20 s，72 ℃ 延伸 20 s，共40 个循环。采用 2-△△CT相对定量法计算各样本中TNF-αmRNA、NF-κBmRNA的相对表达量。引物序列见表5。

表5 引物序列

2.2.6 Western Blot检测胆囊组织中NF-κB蛋白表达水平分别于各组取适量胆囊组织，按照 19 的比例加入含蛋白酶抑制剂的裂解液，4 ℃震荡至组织块全部破碎，置于冰上裂解20 min，4 ℃，12 000 rpm·min-1离心 20 min，取上清。上样等量蛋白经过电泳，转移到PVDF膜上，转膜条件为 200 mA 90 min(0.45 μm膜)，5% 脱脂奶粉室温封闭 2 h，加入相应的一抗(NF-κB、GAPDH稀释比例分别为12 000和15 000)，4 ℃孵育过夜。TBST充分洗涤PVDF膜3次，每次10 min。加入二抗(稀释比例为15 000)，室温孵育1 h。TBST充分洗涤PVDF膜3次，每次10 min。将ECL试剂中增强液与稳定的过氧化物酶溶液按11比例混匀，滴加适量工作液于PVDF膜上，采用全自动化学发光图像分析系统进行曝光，并使用Image J软件分析灰度值。

2.3 结果

2.3.1 十五味赛尔斗丸对胆囊炎豚鼠胆囊组织病理的影响正常组胆囊形态正常，未见病理学改变。模型组豚鼠胆囊明显肿大，组织局部增生、水肿或坏死，炎性细胞浸润，黏膜水肿、散在性脱落、渗血。经过药物治疗后，胆囊组织损伤得到明显改善。见图8。

A：正常组；B：模型组；C：十五味赛尔斗丸水溶液组；D：十五味赛尔斗丸醇提组；E：消炎利胆片组图8 十五味赛尔斗丸对豚鼠胆囊组织病理的影响(HE染色，×400)

2.3.2 十五味赛尔斗丸对豚鼠血清及胆汁中TNF-α含量的影响与正常组相比，模型组血清中 TNF-α 含量明显升高(P<0.01)；与模型组比较，十五味赛尔斗丸醇提组血清中TNF-α含量显著下降(P<0.01)。与正常组相比，模型组胆汁中TNF-α含量有所升高；与模型组比较，各给药组胆汁中TNF-α含量有所下降，但差异均无统计学意义(P>0.05)。见表6。

表6 十五味赛尔斗丸对豚鼠血清及胆汁中TNF-α含量的影响

2.3.3 十五味赛尔斗丸对胆囊炎豚鼠NF-κB和TNF-αmRNA表达水平的影响与正常组比较，模型组TNF-αmRNA、NF-κBmRNA的表达水平明显升高 (P<0.01)。与模型组比较，各给药组NF-κBmRNA表达水平显著降低 (P<0.01)；十五味赛尔斗丸醇提组、消炎利胆片组TNF-αmRNA 的表达水平显著降低(P<0.01)。见表7。

表7 十五味赛尔斗丸对胆囊炎豚鼠NF-κB和TNF-α mRNA表达水平的影响

2.3.4 十五味赛尔斗丸对胆囊炎豚鼠NF-κB蛋白表达水平的影响与正常组比较，模型组 NF-κB 蛋白表达水平显著升高(P<0.01)；与模型组比较，各给药组蛋白表达水平有下降趋势，但差异无统计学意义(P>0.05)。见图9，表8。

图9 Western Blot检测NF-κB蛋白水平表达的影响

表8 十五味赛尔斗丸对豚鼠NF-κB蛋白表达水平的影响

3 讨论

十五味赛尔斗丸系传统藏成药，由印度獐牙菜、唐古特乌头、矮丛凤毛菊、金腰草、石榴子、黑冰片、火硝、波棱瓜子、川木香、角茴香、小檗皮、诃子、洪连、五灵脂、金精石组成[4]，藏医理论认为本方具有清利肝胆湿热、舒胆排石退黄之效，临床常用于肝胆热症、胆囊炎、胆石症、胆总管结石等常见肝胆疾病。现代药理研究发现，十五味赛尔斗丸具有解热镇痛、抑菌、消炎、消肿、利胆溶石、排石，提高机体免疫功能的功效，但其作用机制及有效成分尚不完全清楚，亦无具体的功效药理学评价及分析。但有研究发现，十五味赛尔斗丸组方中单味药的醇提物的利胆等作用效果比水提物强[5]。亦有研究对比发现，乙醇作为提取溶剂，更有利于后续的分离纯化[6]，可为进一步研究提取物的作用效果及有效成分分析，多方面了解药物疗效作用及靶点打下基础。

本研究通过网络药理学和分子对接技术研究发现，十五味赛尔斗丸治疗胆囊炎的关键活性成分有N-methylcorydaldine、氧化血根碱、金圣草(黄)素及7-羟基香豆素。N-methylcorydaldine具有抗分泌活性，可抑制胃酸分泌，其效果媲美奥美拉唑[7]；氧化血根碱具有抗疟活性[8]。金圣草(黄)素具有很强的抗氧化活性，可抑制脂质过氧化[9]；7-羟基香豆素可诱导HepG2细胞凋亡，具有抗肿瘤和免疫调节作用[10]。与核心靶点PIK3CA靶向的活性成分有雏菊叶龙胆酮、白屈菜红碱、原阿片碱、隐品碱、别隐品碱、芹菜素等。雏菊叶龙胆酮是从獐牙菜茎中提取的一种呫吨酮化合物，具有保肝、抗氧化、抗炎、抗肿瘤活性，是免疫缺陷病毒蛋白R的抑制剂[11-13]；白屈菜红碱具有抗肿瘤、抗糖尿病、抗炎活性[14]；Su等[15]研究发现原阿片碱、隐品碱、别隐品碱等生物碱对金黄葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌、大肠杆菌、绿脓杆菌和铜绿假单胞菌都有明显的抑制作用。慢性胆囊炎的成因中包括细菌感染，其病原菌主要来源于肠道，肠道细菌可经胆管至胆囊，以革兰阴性菌为主，其中包括大肠埃希菌等[16]。

通过对关键活性成分进行靶点预测和分子对接发现，TNF、PIK3CA、AKT1、IL-6、EGFR是十五味赛尔斗丸治疗胆囊炎的核心靶点。其中，TNF是与各核心化合物结合表现最好的靶点，TNF是一种调节性细胞因子，是免疫系统中极其重要的信号蛋白。TNF-α、TNF-β是TNF家族重要的成员[17]，TNF-α 主要通过上调MAPK、ERK、NF-kappa B等信号通路来诱导细胞凋亡及促炎症作用[18]。研究证明，PI3Ks可调节参与细胞增殖、黏附、存活和运动的信号通路。对PIK3CA突变的分析表明，PIK3CA增加PI3K信号，刺激下游AKT信号，促进不依赖生长因子细胞的生长并增加细胞侵袭和转移能力[19]。现代医学认为，急性胆囊炎多由大肠杆菌、厌氧杆菌等引起，胆囊结石同样会诱发急性胆囊炎，损伤胆管壁，产生炎性介质如IL-6，继发性引起炎性细胞因子升高，参与炎症反应[20]。有研究证实，急性胆囊炎患者血中革兰阴性杆菌感染易释放过量的内毒素，诱导IL-6等入血，引起炎性链级反应，导致多器官障碍和并发症[21]。所有存在结石的胆囊均有炎症反应变化，炎症与黏蛋白的分泌异常有一定关系[22]，EGFR对于黏蛋白合成有中心调节作用，进而促进胆囊结石的形成[23]。此外，部分靶点如AKT1[24]、VEGFA[25]等与肿瘤表达密切相关，推测十五味赛尔斗丸在治疗肿瘤方面具有一定的潜能。根据《胆囊癌诊断与治疗》2019版[26]，胆囊炎为胆囊癌发病相关的危险因素。

GO富集分析发现，十五味赛尔斗丸可改善对细胞缺氧的反应、对脂多糖的反应[27]以及氧结合等功能。由于代谢高度活跃的常驻细胞和活化的浸润免疫细胞耗氧量增加以及血管功能障碍导致的氧气供应减少，因此，缺氧常作为慢性发炎组织的显著特征。组织缺氧会对免疫和非免疫细胞中的炎症信号通路产生重大影响，影响疾病进展[28]。KEGG通路分析提示，十五味赛尔斗丸主要是通过HIF-1信号通路、TNF信号通路等发挥协同作用来治疗胆囊炎。HIF-1水平的变化与AKT、NF-κB通路有关，还可诱导VEGF的转录，是干预炎症损伤、氧化应激、凋亡等的重要信号通路[29]。NF-κB信号通路的激活，可以有效抑制NF-κB介导的TNF-α、IL-1、IL-6等炎症因子及其蛋白的表达，减轻全身炎症反应和各组织器官的急性损伤[30]。虽然 NF-κB 信号通路在KEGG富集结果中排名未进入前20，但参考前期课题组研究，经过查询文献和讨论后，认为其有重要的研究意义。

为了验证十五味赛尔斗丸对胆囊炎模型的影响，本研究进一步采用皮下注射盐酸林可霉素建立豚鼠胆囊炎模型。结果显示，模型组血清中 TNF-α 含量明显升高，提示胆囊出现部分炎症反应；各给药组TNF-α含量明显下降，且十五味赛尔斗丸醇提组中TNF-α含量低于十五味赛尔斗丸水溶液组。与模型组比较，各给药组NF-κBmRNA表达水平显著降低，十五味赛尔斗丸醇提组、消炎利胆片组TNF-αmRNA 的表达水平显著降低，且十五味赛尔斗丸醇提组作用效果更明显。

综上，本研究通过网络药理学和分子对接技术初步预测十五味赛尔斗丸可通过多成分、多靶点及多通路治疗胆囊炎；动物实验显示十五味赛尔斗丸可通过激活NF-κB信号通路抑制TNF-α等炎症因子及其蛋白的表达，减轻炎症反应，从而治疗胆囊炎，与预测结果存在高度一致，明确了本次网络药理学和生物信息学预测的可靠性，为今后继续研究相关成分治疗胆囊炎的作用机制提供了重要依据。