肿瘤浸润性淋巴细胞免疫治疗的研究进展

杨涵 陈超 王冲

摘 要 肿瘤浸润性淋巴细胞（tumor-infiltrating lymphocytes， TILs）免疫治疗通过体外分离、扩增和回输患者自己的能特异性识别肿瘤组织的肿瘤浸润性T淋巴细胞来治疗肿瘤，是目前主要的过继性细胞免疫治疗类型之一。TILs已在用于实体瘤治疗的临床试验，尤其是在用于转移性黑色素瘤患者治疗时显现有令人鼓舞的临床效果。然而，TILs治疗也面临一些挑战，如肿瘤相关抗原反应性T细胞难以分离及其在体内的持久性和安全性等。本文概要介绍TILs治疗的产品生产过程、临床应用的可行性、临床研究进展，以及TILs治疗面临的挑战和解决措施，供TILs治疗的研究与开发者参考。

关键词 肿瘤浸润性淋巴细胞 实体瘤 临床研究

中图分类号：R979.19 文献标志码：A 文章编号：1006-1533（2022）11-0017-05

引用本文 杨涵， 陈超， 王冲. 肿瘤浸润性淋巴细胞免疫治疗的研究进展[J]. 上海医药， 2022， 43（11）： 17-21.

Research progress in tumor-infiltrating lymphocytes immunotherapy

YANG Han， CHEN Chao， WANG Chong

（Shanghai Center for Drug Evaluation and Inspection， Shanghai 201210， China）

ABSTRACT Tumor-infiltrating lymphocytes （TILs） therapy is one of the main types of adoptive cellular immunotherapy by harvesting infiltrated lymphocytes from tumors followed by ex vivo expansion and then infusing them back to patients themselves. TILs therapy has shown encouraging clinical effects in clinical trials against solid tumors， especially in treating metastatic melanoma. Nevertheless， various barriers restrict the efficacy and prevent the widespread use of TILs therapy， such as the difficulty of isolating tumor-associated antigen-reactive T cells and their persistence and clinical safety in vivo. Herein， we summarize the manufacturing process of TILs and the feasibility analysis of the clinical application and discuss the advances in clinical trials and the current obstacles with some strategies to be overcome， shedding light of the development of the next generation of TILs therapy.

KEY WORDS tumor-infiltrating lymphocytes； solid tumors； clinical trials

細胞免疫治疗，又称过继性细胞免疫治疗，是一种基于细胞的治疗方法，其使用患者自身或供体的经过基因工程改造和/或离体扩增的免疫细胞来改善患者的免疫功能，以对抗肿瘤。在实体瘤治疗领域，肿瘤浸润性淋巴细胞（tumor-infiltrating lymphocytes， TILs）治疗被认为是最有潜力的细胞治疗类型之一[1]。

TILs治疗始见于20世纪80年代后期。当时，美国国家癌症研究所的Rosenberg团队在多种肿瘤模型小鼠中成功分离出TILs，经对环磷酰胺处理后的肿瘤小鼠给予TILs和白介素-2联合治疗，发现100%消除了MC38结肠腺癌肝转移模型小鼠的肿瘤细胞[2]。1988年，TILs首次用于临床，与白介素-2联合治疗经环磷酰胺处理的15例转移性黑色素瘤患者，结果发现客观缓解率高达60%[3]。本文概要介绍TILs治疗的研究进展，供相关研究与开发者参考。

1 TILs治疗产品的生产过程

尽管用于不同肿瘤患者的TILs来源不同，但最终回输到患者体内的TILs治疗产品的生产过程都是相似的，主要包括前快速扩增（对自肿瘤组织中分离出来的TILs进行初步扩增）、快速扩增（分选出能杀伤肿瘤组织的高活性TILs且对其进行快速扩增）和回输到患者体内3个阶段。整个生产过程均应符合药品生产质量管理规范的要求，包括生产设施、工艺和质量管理体系等。

目前，TILs治疗产品的基本生产过程[4]为：先通过外科手术切下患者肿瘤，将肿瘤切成多个小段或用胶原酶消化为单细胞悬液，然后置于富含白介素-2的培养基中培养。随着时间推移，培养基中的肿瘤细胞被全部杀死。整个前快速扩增通常需持续3 ～ 5周。当TILs被培养至一定的细胞密度后，通过检测能否分泌干扰素-γ来确定具有高抗肿瘤活性的TILs，并通过快速扩增技术将其扩增至所需数目。快速扩增阶段中，不同类别的T淋巴细胞均得到扩增。使用患者的肿瘤细胞与扩增后的T淋巴细胞进行反应测试，将分选出的具有肿瘤杀灭效力的T淋巴细胞继续扩增。扩增时需要使用经过辐照的健康个体来源的外周血单核细胞充当饲养层细胞、抗CD3单克隆抗体和高剂量的白介素-2来促进TILs的快速增殖。整个TILs治疗产品的生产周期通常为5 ～ 7周。038C597C-F774-40C1-9DC1-F6FE2E5B0876

2 TILs治疗产品临床应用的可行性

2.1 多靶点

肿瘤具有异质性，其在发生发展过程中并不是一成不变的，往往能通过抗原表位突变或表达丧失来逃避免疫检查点抑制剂、T细胞抗原受体（T cell receptor， TCR）T细胞和嵌合抗原受体T细胞（chimeric antigen receptor T cells， CAR-T）等免疫治疗的攻击。而TILs治疗产品则由于其T淋巴细胞群表面TCR的多样性，能识别一系列肿瘤抗原，故可很大程度地避免此类事件的发生[5]，很好地应对肿瘤的异质性。因此，对于具有高突变负荷的黑色素瘤等实体瘤，TILs的治疗效果优于CAR-T[6]。

2.2 优越的肿瘤归巢能力

高剂量白介素-2治疗会增加肿瘤微环境中趋化因子受体CCR5和CXCR3的配体（CCL3、CCL4、CXCL9、CXCL10、CXCL11等）的表达[7]。而TILs倾向于主要由效应记忆T细胞组成，它们的表面表达着趋化因子受体，如CCR5和CXCR3等。因此，当被回输到患者体内后，TILs可很容易地浸润肿瘤组织[8]。

2.3 较低的脱靶毒性

由于TILs治疗产品所含T淋巴细胞中已排除了容易攻击自身细胞的T细胞，故其治疗的脱靶毒性通常较低。作为比较，CAR-T表面的嵌合抗原受体中的单链可变片段或TCR T细胞表面的工程化TCR若与正常组织的抗原有交叉反应性，则往往会产生脱靶毒性[9]。

2.4 可用于高度耐药患者治疗

TILs治疗有使高度耐药的肿瘤患者受益的潜力。有研究显示，在经抗细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4和抗程序性死亡受体-1 （programmed cell death-1， PD-1）药物治疗后复发的黑色素瘤患者中，TILs治疗仍可能具有诱导患者产生肿瘤特异性免疫反应的效力，使12例免疫治疗失败患者中的2例达到了部分缓解[10]。

2.5 能提高其他免疫治疗的效果

TILs聯合抗PD-1药物治疗的效果优于单用抗PD-1药物。由于TILs治疗产品中含有大量的CD8+ T细胞，后者能介导干扰素-γ的表达和分泌，而干扰素-γ分泌增多又会诱导肿瘤细胞内的程序性死亡受体配体-1的表达和上膜[11]，故可提高抗PD-1药物的治疗效果。

3 TILs治疗的临床研究进展

近年来，人们开展了大量的TILs治疗临床研究，以观察和评估TILs治疗对黑色素瘤、卵巢癌、肺癌和肉瘤等的效果。其中，TILs治疗实际用于黑色素瘤患者已有20多年历史。肿瘤特异性T细胞虽能很大程度浸润到黑色素瘤，但却似乎不会发生反应。而当这些T细胞被从肿瘤微环境中取出并用白介素-2在体外培养、激活和扩增，再回输至患者体内后，却有了很好的肿瘤杀伤效力，使黑色素瘤达到持久的完全缓解[3， 12-13]。目前研究显示，TILs治疗黑色素瘤和宫颈癌的效果较为突出，代表性的产品是Iovance生物治疗有限公司的LN-144（lifileucel）[14]和LN-145。对于非小细胞肺癌[15]、骨肉瘤[16]和卵巢癌，TILs治疗也被证实有一定的效果。截至今日，全球尚无TILs治疗产品获准上市。不过，lifileucel已在美国提出了生物制剂许可申请，可能于2022年内获得批准。该产品于2019年获得了美国FDA的突破性治疗药物认证。

4 TILs治疗临床应用面临的挑战与解决策略

4.1 具有抗肿瘤活性的TILs分离困难

尽管TILs治疗已被证实对实体瘤有效，但不是所有的肿瘤组织中都存在比较多的免疫浸润淋巴细胞。而且，TILs治疗产品的生产须通过外科手术获取的肿瘤组织作为初始物料，这对绝大多数晚期肿瘤患者来说是不现实的。此外，就算肿瘤组织中存在免疫浸润的淋巴细胞，也很难从中分离出真正具有抗肿瘤活性且增殖能力强的TILs。事实上，TILs是一个异质性群体，不仅包含肿瘤相关抗原反应性T细胞（tumor-associated antigenreactive T cells， TAA-T），还包含识别非肿瘤（主要是病毒）表位的旁观者T细胞，只有约30%的TILs是能与肿瘤细胞发生反应的[17]。然而，目前还无有效的标记方法来特异性地识别、分离TAA-T和旁观者T细胞。尽管通过检测细胞表面标志物（如PD-1）可在一定程度上富集肿瘤反应性TILs[18]，但肿瘤微环境中也存在表达这些标志物的旁观者T细胞[19]。

目前，TAA-T的分离主要是利用反向免疫学[20]找到同源肽-主要组织相容性复合体（homologous peptidemajor histocompatibility complex， pMHC），再通过pMHC与TCR的相互作用来实现的[21]。即先对肿瘤细胞进行全外显子测序找到非同义突变[22]，结合找到的多肽序列生成候选肽，再利用质谱[23]或算法（如特定位置的评分矩阵、机器学习算法）[24]来预测能结合人主要组织相容性复合体的表达产物人白细胞抗原（human leukocyte antigen， HLA）的候选肽，最后用荧光候选肽-HLA多聚体来找到TAA-T。尽管已取得一些成功，但大部分算法确定的候选肽并不具有免疫原性，不能诱导抗肿瘤免疫反应，因为现有的计算工具不能完全准确地预测T细胞的反应性[25]。此外，这类方法往往需要较长的周转时间。近期，有研究者开发了一种基于细胞-细胞相互作用的新邻近标记方法，通过化学合成的供体底物GDP-FucBiotin将TILs中的TAA-T与旁观者T细胞区分开来[26]，从而获得具有更强抗肿瘤活性的TILs治疗产品。不过，该方法所用供体底物的特殊性和高成本可能会限制其在生产实际中的应用。

4.2 TILs在体内的持久性不高

在将TILs治疗产品回输到肿瘤患者体内前，须先使TILs的数目扩增至109 ～ 1011数量级。扩增过程中不但会扩增TILs的数目，而且会促使T细胞分化及其表型发生变化。这些都会影响TILs回输后在体内的增殖能力和持久性。038C597C-F774-40C1-9DC1-F6FE2E5B0876

Rosenberg等[27]通过逆转录病毒将新霉素磷酸转移酶基因转导到TILs中来进行标记，发现在TILs回输后的前21 d内，仅有1/10 000 ～ 1/300的基因修饰TILs持续存在于循环中。Robbins等[28]通过对25例先后接受非清髓性化疗和TILs治疗的转移性黑色素瘤患者的外周血样本进行序列分析来检测T细胞受体β可变区基因的相对表达率，从而评估T细胞多克隆群中存在的单个克隆型的相对频率，发现肿瘤消退与过继性T细胞的持久性显著相关，表明T细胞持久性不高可能是限制过继性T细胞治疗效果的主要因素。

Rosenberg等[29]发现，在对肿瘤患者回输TILs前先进行非骨髓性淋巴细胞清除可显著增强TILs在体内的增殖能力和持久性。他们对93例转移性黑色素瘤患者进行持续2 d的环磷酰胺60 mg/kg和持续5 d的氟达拉滨25 mg/m2治疗以清除非骨髓性淋巴细胞，然后回输TILs治疗。结果显示，52例（56%）患者有客观应答。共有20例（22%）患者达到完全缓解，其中19例患者的完全缓解期>3年。Tran等[30]提出了在不筛选TAA-T的情况下分选“年轻的TILs”以简化TILs治疗产品生产的设想。他们在对34份肿瘤样本进行测试后发现，年轻的TILs尽管具有显著不同的T淋巴细胞组成，但却都能表现出与常规TILs相当的特异性抗肿瘤效力，与临床需求的匹配度更高。

4.3 TILs治疗的不良反应

TILs治疗产品本身的毒性较低，但要维持回输到患者体内的TILs的增殖和存活还须同时给予高剂量的白介素-2，后者常会导致细胞因子风暴、毛细血管泄漏综合征[31]、免疫抑制等不良事件的发生[32]。白介素-2的毒性呈剂量依赖性，剂量过高会导致毛细血管通透性增加，使得体液外渗到器官中而引起器官损伤，同时有发热、寒战、呼吸困难、腹泻等不良反应。

由于大多数白介素-2相关的毒性都会在白介素-2给药后2 ～ 5 d内显著降低，故对白介素-2毒性管理的关键在于何时开始下一剂给药。白介素-2的毒性通常在其给药后4 ～ 6 h达到峰值，一般会在预定的下一剂给药前消退[33]。此外，Yao等[34]对多项TILs治疗转移性黑色素瘤患者临床试验数据的分析发现，白介素-2可通过介导CD4+调节性T细胞重建来抑制TILs的抗肿瘤免疫反应，其给药次数与TILs治疗效果呈负相关性。

5 下一代TILs治疗产品

常规TILs治疗产品因有体外扩增过程，使得大部分TILs成为耗竭性T细胞，肿瘤杀伤效力和持久性都难令人满意。为克服这些缺陷，研究者们正在尝试对TILs进行基因改造。据悉，国内已借助“增强受体”和“扩增因子”等专利技术对TILs进行基因改造，制备出了“超级TILs”，旨在解决实体瘤异质性、肿瘤微环境等对TILs治疗的影响。嵌合抗原受体TILs用于实体瘤治疗的临床试验也在计划中。目前，新一代或称下一代TILs治疗产品的发展方向主要聚焦在如下4个方面：增强TILs靶向和识别肿瘤的能力；增强TILs在体内的持久性；增强TILs的肿瘤浸润能力；增强TILs的肿瘤杀伤效力。

在增强TILs靶向和识别肿瘤的能力方面，Mills等[35]构建了由CD3ζ、CD28共刺激信号传导域和肿瘤相关抗原人表皮生长因子受体-2的人源单链抗体融合组成的嵌合抗原受体，然后通过逆转录病毒转导至自黑色素瘤组织中分离出的TILs中，结果发现与非转导TILs相比，转导TILs在用于黑色素瘤治疗时的细胞因子分泌量有小幅增加，但肿瘤杀伤效力没有明显增强。这可能与转导TILs的体外培养时间过长、体内增殖率低，以及转导本身的效率不高等因素有关。

在增强TILs在体内的持久性方面，Heemskerk等[36]通过逆转录病毒将人白介素-2基因转导至TILs中，结果发现此可提高TILs在体外停用白介素-2后的存活能力，但未能增强TILs在体内的持久性和反应性。他们的研究发现，将转导了白介素-2基因的TILs扩增到足够数目往往需要更长的时间，而这可能对TILs的体内增殖能力产生负面影响，致使转导了白介素-2基因的TILs的体内反应性低。

在增強TILs的肿瘤浸润能力方面，Idorn等[37]通过慢病毒将趋化因子受体CXCR2基因转导至TILs中，发现此可显著提高TILs在小鼠黑色素瘤模型中的肿瘤浸润水平。不过，肿瘤归巢能力的提高能否增强TILs的治疗效果，目前还不清楚。

在增强TILs的肿瘤杀伤效力方面，Zhang等[38]通过将白介素-12基因转导至TILs中来促使肿瘤微环境中骨髓来源的细胞从免疫抑制重编码为免疫激活状态，从而介导浸润性肿瘤破坏。这种转导TILs虽治疗转移性黑色素瘤患者的客观反应率达63%，但其在体内不能长期持续存在，且有严重的剂量限制性毒性。

6 结语

目前，TILs治疗渐趋成熟，并已在治疗黑色素瘤、卵巢癌、肺癌和肉瘤等多种实体瘤方面显现有较好的效果。但TILs治疗现仍面临一些挑战，包括TAA-T难以分离及其在体内的持久性和安全性等。相信随着相关研究的深入，TILs治疗将得到不断发展，从而真正走上临床，造福众多肿瘤患者。

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