虎杖叶片两种次生代谢物含量的纬度变异及影响因子

赵玮晗，毕景文，赵玉杰，邱士允，Madalin Parepa，Oliver Bossdorf，Christina Richards,3，鞠瑞亭，吴纪华，廖志勇，李 博

(1.复旦大学 生命科学学院 生物多样性和生态工程教育部重点实验室，上海 200438；2.图宾根大学 进化与生态研究所，德国 图宾根 D-72076;3.南佛罗里达大学 整合生物学系，美国 坦帕 33617;4.中国科学院 西双版纳植物园 热带森林生态学重点实验室，云南 勐腊 666303)

植物次生代谢物质是一大类在植物体内合成但却不直接用于植物生长或繁殖的有机物[1]，其通常是初级代谢过程的中间产物[2]。植物叶片次生代谢物的表达被广泛认为是植物响应外界环境变异的重要性状[3-6]，在植物防御草食昆虫和动物取食、抵御病原菌侵染[3-4]和响应非生物环境因子胁迫中具有重要作用[7]。植物次生代谢物质含量的变化能够进一步改变植物体内其他代谢途径[8]，影响凋落物理化水平[8]，并最终影响生态系统过程。在自然界，植物次生代谢物质含量被认为是生物间相互作用、气候因子以及土壤养分状况三方面互作的结果[9-12]。其中，草食作用被认为是植物防御性次生代谢物质含量变异的主要因素[13]，由此提出了草食作用-植物防御的纬度梯度假说[3]。然而，由于植物次生代谢物质具有广泛的生态功能，其他非生物因子对于其含量同样具有显著影响[9,11]。因此，虽然不同生物与非生物因子对植物次生代谢物质含量的影响在以往研究中有报道，但尚未得到一致性结论。

沿纬度梯度环境因子的变异是生态学和生物地理学中的经典格局[14]，被广泛用来研究多种生物与非生物因子对于植物次生代谢物质含量的影响[9,15-16]。例如，乌桕(Triadicasebifera(L.) Small)种群叶片单宁含量随纬度升高而降低，在受到严重草食作用影响的种群中，作为防御物质的单宁含量显著较高，而非生物环境因子对于其变异没有显著影响[12]。但对于夏栎(QuercusroburL.)不同纬度的多个种群叶片草食作用与防御性次生代谢物质的研究发现，与生境温度、降水和土壤孔隙率相关的因子能够直接影响叶片酚类物质的含量，而草食作用强度与防御作用的次生代谢物质含量显著负相关，进一步通过结构方程模型说明次生代谢物质的含量首先响应非生物环境影响，进而产生对草食者的影响[11]。类似地，对该物种的另一项研究发现，叶片酚类物质含量受到温度和土壤碳储量的影响，与草食作用强度没有显著关系[9]。因此，亟待结合草食作用以及非生物环境因子分析影响种内重要次生代谢物质含量变异的主要因素[3]，为进一步认识次生代谢物质的生态功能，深入理解物种响应环境变异的关键性状与策略选择[17-18]，及更普遍的宏观生态格局研究提供参考[19]。

虎杖(ReynoutriajaponicaHoutt.)是蓼科虎杖属的多年生草本植物，由于其能够代谢产生大量活性物质，在我国作为药材已有1500年历史[20-21]。其中，白藜芦醇作为一种植物天然代谢的多酚类抗氧化剂[7]，是虎杖较为特殊的次生代谢物之一[22]，因其对人类健康的潜在益处(包括抗癌作用，抗衰老和广谱抗菌特性等)而在近年来受到广泛关注[7]。植物叶片白藜芦醇含量与真菌侵染和紫外辐射强度有关[23-24]。同时，白藜芦醇溶液对部分植物的广食性和专食性草食者能产生负面影响，可能有抵御叶片取食者的防御功能[25]。但是，野外跨纬度梯度白藜芦醇含量的变异与影响因子及其与实际草食作用的关系，尚未有研究报道。同样作为酚类化合物，单宁类物质广泛存在于大量植物中，具有明显的化学防御作用[26-27]。单宁能利用其结合蛋白质的能力，作为草食性昆虫的消化抑制剂以抵御其进一步取食[28]；能在碱性环境中起到氧化作用，对昆虫造成不利影响[26-27]。作为虎杖响应生物和非生物环境因子变异的潜在性状，尚未有研究报道其叶片单宁类物质含量的纬度变异格局。本文拟通过对华南与华东地区不同虎杖种群叶片中白藜芦醇与总单宁含量，以及草食作用程度的调查，分析两种次生代谢物质与各种群草食作用强度及来源生境中非生物环境因子间的关系，回答下列科学问题: (1) 虎杖叶片重要次生代谢物质白藜芦醇和单宁含量是否存在显著的纬度变异；(2) 影响两种次生代谢物质纬度变异的因素是什么，二者之间是否存在差异；(3) 不同影响因素的相对重要性在两种物质之间是否存在差异？

1 材料与方法

1.1 研究材料与研究区概况

虎杖(R.japonicaHoutt.)原产于亚洲大陆东岸的亚热带与温带地区[29-30]，包括中国、朝鲜与日本，在我国的东南部地区各省份有较为广泛的分布，尤其偏好小溪、农田与竹林边缘的生境。

1.2 研究区与调查方案

野外调查于2020年植物生长旺季进行。在我国华东与华南地区(北纬23.29°～32.85°)虎杖主要分布范围内，对虎杖37个野生种群进行了调查与采样(图1,表1)。

图1 虎杖种群调查和采样地点及主要环境因子Fig.1 Locations and main environmental factors of the sampled R.japonica populations

表1 虎杖种群调查和采样地点及主要环境因子Tab.1 Sampling locations and main environmental predictors of R.japonica population

在每一个地点，尽量选择相对较大的种群(长度>30 m)进行调查，每个种群设置5个1 m×1 m的调查样方，相邻样方间至少间距5 m。在各样方内随机选择1株中等大小的虎杖目标个体，采集其主茎顶端的5片完全展开叶，用于测定叶片所受草食作用程度。同时采集3～5个分枝上的所有完全展开叶，用于叶片次生代谢物质的测定。采集后立即将所有叶片置于放有冷冻冰袋的保温箱中，并于采集当天对所有叶片进行叶面积测定。同时，在每个样方内应用五点法随机采集表层10 cm深的土壤样品，去除样品中的根系等植物组织，混合均匀后用于后续的养分指标分析。土壤样品同样置于放有冷冻冰袋的保温箱中于次日寄回实验室保存在4 ℃冷库中直至送样分析。

1.3 叶片草食作用程度的测定

前期野外观察发现不同虎杖种群在野外存在不同程度的叶片缺刻，所以本研究仅关注缺刻型草食作用强度。本研究使用虎杖个体主茎顶端的5片完全展开叶，基于两种方式衡量个体叶片所受草食作用程度: (1) 目标个体叶片中受损叶片数量比例，和(2) 叶片被取食面积占比。其中，叶片受损面积比例=(总叶面积-实际叶面积)/总叶面积[31]；首先利用新鲜叶片扫描照片(Epson Perfection V330)，使用Image J软件(Image J 64-bit Java 1.8.0 172)计算实际叶面积，之后使用Adobe Photoshop CC 2018软件基于虎杖叶形进行叶面积补全，使用Image J软件计算总叶面积(图2)。

图2 叶片所受草食作用程度计算方法Fig.2 Method of estimating the degree of herbivory damage on leaves

1.4 叶片次生代谢物质的测定

白藜芦醇的测定参照刘臣和唐长波[32]的方法，使用甲醇溶液避光超声提取过筛后的叶片样品，取上清液，使用高效液相色谱进行测定(Waters 2695 HPLC System w/UV Detector, Marshall Scientific, USA)。单宁的测定参照Folin & Denis[33]的方法，使用酶标仪(M200 microplate fluorometer, Grodig Tecan infinite, Switzerland)完成测定。

1.5 野外种群环境参数的测定与信息收集

野外采集的土壤样品自然风干，称取部分研磨后样品使用元素分析仪(vario MACRO cube, Elementar, Germany)测定土壤总碳、总氮以及有机碳、有机氮含量。同时针对其他元素的不同特性，分别使用比色法(UV-755B分光光度计，上海精密科学仪器有限公司)和火焰原子吸收分光光度法(Z-2300火焰原子吸收分光光度计，日本日立公司)测定土壤总磷、总钾、总钙、总镁含量，及有效磷、有效钾、有效钙和有效镁含量。

为研究不同环境因子对虎杖叶片次生代谢物纬度变异的影响程度，基于野外调查中确定的各虎杖种群位置，从世界气候数据库(WorldClim version 2.1)[34]的生物气候数据产品中提取部分气候数据，分辨率约为30 s，这些气候数据均为近30年的平均数值，适用于植物功能性状生物地理格局及其影响因素的研究[11]。基于以往研究[9-12]，温度、降水和太阳辐射变量可能叶片次生代谢物质含量有较大相关性，因此我们提取数据库中的年均温(BIO1，℃)、温度季节性(BIO4)、年最高温(BIO5，℃)、年最低温(BIO6，℃)、温度年较差(BIO7，℃)、年降水量(BIO12，mm)、最湿润月降水量(BIO13，mm)、最干燥月降水量(BIO14，mm)和降水季节性(BIO15)用于后续分析。其中季节性变量表示温度和降水在一年内变化的平均幅度，使用各月温度和降水多年平均值的标准偏差计算得到[34]。由于叶片白藜芦醇含量可能受到太阳辐射强度的影响[23-24]，我们同时在该数据库中提取近30年中每个月的平均太阳辐射量数据，分辨率约为30 s；计算太阳辐射年均值(kJ·m-2·d-1)、太阳辐射年较差(kJ·m-2·d-1)、夏季太阳辐射值(kJ·m-2·d-1)以及冬季太阳辐射值(kJ·m-2·d-1)。

1.6 统计分析

由于非生物环境变量间存在共线性，我们首先对温度、降水、土壤和太阳辐射变量分别进行主成分分析，并基于变量相关系数，选择部分变量进行后续分析。

本研究使用线性混合效应模型分析次生代谢物质与纬度的关系，同一采样种群内的5个目标个体作为纬度内的重复加入随机效应。由于pop 6次生代谢物质数据测定异常，所以在统计分析过程中剔除该记录。由于叶片次生代谢物质含量有可能随纬度呈现非单调关系，所以在“纬度”作为固定效应的模型基础上，增加“纬度的平方项”重新建立模型，使用赤池信息准则AIC值较小的模型[12]，确定变量与纬度的关系。使用针对所有固定效应的残差图检验模型的正态性与方差齐性假设。使用似然比检验方法(likelihood ratio tests,χ2test)检验纬度对各个变量影响的显著性，并计算模型决定系数。

对于叶片草食作用程度变量(受损叶片数量比例与叶片受损面积比例)的相关性分析显示，二者呈现显著的正相关关系(r=0.47，P<0.001)，所以后续使用受损叶片数量比例作为衡量草食作用的指标。本研究使用线性混合效应模型分析次生代谢物质含量变异的影响因素，分别以叶片白藜芦醇与单宁含量为响应变量，建立多元回归模型，使用方差膨胀因子(VIF)检验解释变量共线性，并使用解释变量的残差图进行模型假设检验，通过似然比检验方法检验各个变量影响的显著性，并计算模型决定系数。进一步基于多元回归模型结果，使用hier.part包提供的层次划分算法[35]，计算显著解释变量对响应变量的独立影响百分比，得到变量的相对贡献度。最后基于Larsen和McCleary的方法[36]绘制偏残差图，分析多元回归中响应变量与主要解释变量的关系。所有分析均在R 4.0.3软件中进行(R Core Team, 2021)。

2 结 果

2.1 非生物环境因子的主成分分析

草食作用与所有非生物环境因子主成分得分值的相关性分析结果显示，部分变量之间存在较强相关关系。为排除解释变量共线性的影响，同时基于主成分分析的结果，选择草食作用，以及温度、降水、土壤和太阳辐射各自的第一主成分用于后续分析。温度第一主成分解释了原始变量69.9%的变异，温度季节性(BIO4)与年最低温(BIO6，℃)对其贡献最大，其中温度季节性与温度第一主成分呈正相关，而年最低温与之呈负相关。降水第一主成分解释了原始变量58.5%的变异，最湿润月降水量(BIO13，mm)对其贡献最大，呈正相关。土壤变量第一主成分解释了原始变量36.8%的变异，碳、氮元素以及有机碳、有机氮含量对其贡献最大，呈正相关。太阳辐射变量主成分结果显示，第一主成分解释了原始变量67%的变异，太阳辐射年较差对于第一主成分贡献最大，呈正相关。

2.2 虎杖叶片次生代谢物质的纬度变异

图3 虎杖叶片(a) 白藜芦醇含量与(b) 总单宁含量的纬度格局Fig.3 Latitudinal variation of the content of (a) resveratrol and (b) tannin in leaves from different Reynoutria japonica populations图中P值为线性混合效应模型似然比检验的P值，NS表示变量与纬度无显著关系。

表2 虎杖叶片白藜芦醇与单宁含量的(a) 纬度变异及(b) 其与草食作用和非生物影响因子的检验总结Tab.2 Latitudinal variation (a), and the effects of herbivory damage and abiotic factors (b) on the content of resveratrol and total tannin in leaves from different R.japonica populations

2.3 虎杖叶片次生代谢物质纬度变异的影响因素及其相对重要性

对虎杖不同种群叶片白藜芦醇含量多元回归分析结果表明，其含量变异受到草食作用、温度、降水以及太阳辐射的显著影响(表2(b))。对显著解释变量的相对贡献分析结果显示(图4)，温度第一主成分是对叶片白藜芦醇含量解释度最高的因子，其次是太阳辐射与降水第一主成分，草食作用程度解释度次之。偏残差分析显示，温度第一主成分与白藜芦醇含量显著正相关(图5(a)，表2(b))，即在温度季节性越高、年最低温越低的生境中，虎杖叶片白藜芦醇含量越高。降水与太阳辐射第一主成分，以及草食作用程度与叶片白藜芦醇含量变异方向相反(图5(b～d)，表2(b))，即随着最湿润月降水量的下降、太阳辐射年较差的下降，同时叶片所受草食作用程度的下降，虎杖种群叶片白藜芦醇含量上升。对虎杖叶片单宁含量多元回归分析结果表明，其含量变异与草食作用无显著关系，而只受温度因子的影响(表2(b))。偏残差分析显示，温度第一主成分与单宁含量显著正相关(图5(e)，表2(b))，与白藜芦醇结果相似，即在温度季节性越高、年最低温越低的生境中，虎杖叶片单宁含量越高。

图4 虎杖来源生境中不同影响因子对叶片 白藜芦醇含量的相对贡献度Fig.4 The relative importance of different factors to the content of resveratrol in leaves from different R.japonica populations

图5 虎杖叶片白藜芦醇和总单宁含量与多元回归模型中各显著影响因子的关系(图中的所有值均为偏残差结果)Fig.5 The relationships between significant variables of multiple regressions and the content of resveratrol and total tannin in leaves from different R.japonica populations (All the values of the X and Y axis are the partial residuals for different variables)

3 讨 论

叶片次生代谢物质对植物响应外界环境变化具有重要作用[3-6]。已有研究表明，植物叶片次生代谢物的含量会受到以草食作用为主的生物间相互作用、气候因子和土壤因子等因素的影响[9-12]，但不同影响因子对叶片次生代谢物质含量变异的相对贡献尚未得到一致性的结论。本研究结果显示，虎杖叶片中白藜芦醇含量随纬度增加而显著降低，而总单宁含量随纬度变化未呈现显著变异。二者含量均与生境的温度季节性呈显著正相关，叶片白藜芦醇含量还与最湿润月降水量、太阳辐射年较差和叶片草食作用呈显著负相关。由此可见，虎杖叶片中两种酚类次生代谢物质的含量是以温度季节性为主的多种环境因子综合影响的结果，暗示不同次生代谢物质可能具有多种不同的生态功能。本研究结果加深了对植物叶片次生代谢物质的纬度变异格局及其成因的认识，同时对虎杖资源的开发利用具有一定参考价值。

虽然很多研究关注白藜芦醇的抗癌、抗衰老作用和广谱抗菌特性等有益于人体健康的功效[22]，但早期研究更倾向关注白藜芦醇在植物体内合成的影响因素及其生态功能[23]。白藜芦醇最初被认为是植物体内响应真菌侵染和紫外辐射的保护性次生代谢产物[7]，是重要的诱导性物质[24]，葡萄果实和叶片中的白藜芦醇含量被认为是其对真菌侵染抗性水平的体现[37]。野外生境中白藜芦醇含量的影响因素研究较为有限[7]。本研究的结果显示，野外生境中较高的温度季节性，可能是驱动虎杖叶片白藜芦醇含量升高最为重要的环境因子，生境太阳辐射条件与最湿润月降水量也对于叶片白藜芦醇含量有显著影响。有研究表明，植物生长季的温度与降水总量对于草本植物叶片真菌病害的发生具有显著影响[38-40]。同时，在本研究的野外调查中也发现，虎杖种群叶片真菌病害的发生情况较为普遍。因此，虎杖生境年尺度上较大的温度波动和夏季更丰富的降水，可能通过促进虎杖叶片真菌病害的发生，进而诱导叶片白藜芦醇平均含量上升。本研究还发现虎杖叶片白藜芦醇含量受到太阳辐射年较差的影响，即在生境太阳辐射条件越稳定、总量越高的情况下，其含量越多。该结果与在其他物种中发现的紫外辐射是诱导植物合成白藜芦醇的研究结果一致[23-24]。说明虎杖叶片白藜芦醇含量可能受太阳辐射诱导，在虎杖生长过程中起到了抵御过高辐射的作用。

很多关注草食作用与植物化学防御之间关系的研究，使用单宁类物质含量作为衡量植物化学防御水平的指标，如木本植物叶片中的缩合单宁和没食子酸单宁[41]。但本研究的结果显示，虎杖叶片中总单宁含量与草食作用的变异无关。有研究表明，叶片中以单宁为代表的次生代谢物质含量的变异，与植物资源分配和防御策略变异有关[17-18]，即单宁含量与其他植物功能性状间存在权衡关系。例如，部分植物在应对纬度梯度上外界环境变异时，表现为以各类功能性状为基础的防御综合征的动态变化[42-43]，包括物理防御性状和化学防御性状的权衡，诱导和组成性防御性状的权衡，以及抗性和耐受性之间的权衡[43]。因此，本研究中虎杖叶片单宁含量可能由于上述权衡关系的动态变化而产生变异，这需要继续结合虎杖其他功能性状分析纬度梯度上虎杖适应策略的变异，以深入认识野外情况下虎杖叶片单宁的影响因素与生态功能。

经典的草食作用-植物防御的纬度梯度假说(Latitudinal Herbivory-Defense Hypothesis, LHDH)[3]认为，低纬度地区的植物倾向于受到更高的草食作用压力，植物自身也因此将投入更多资源用于防御相关性状，即生物间相互作用是影响植物次生代谢物质含量的主要因素。本研究中，仅白藜芦醇含量与草食作用显著相关，且相对贡献度较低，变异方向相反，不符合上述假说。Moles等[44]对于20年来LHDH假说相关研究进行了整合分析，结果发现缺乏支持该假说的一致性证据。归结其原因大致有几个方面: 研究所采用的衡量草食作用的方法各有差异[45]；相同次生代谢物质在不同的物种和环境条件下可能有不一致的生态功能[46]。本研究纬度跨度较小，且只关注缺刻型草食作用强度的变异，一些虎杖专食性叶片草食者和其他类型的草食作用并未记录，而单宁的消化抑制功能往往针对性响应某些专食性草食者的草食作用[47]，因此虎杖草食作用与单宁的变异与经典假说不符。同时本研究结果显示，更高程度的草食作用会出现在叶片白藜芦醇含量较低的种群中，说明虎杖叶片中的白藜芦醇在响应温度与太阳辐射的同时，可能具有化学防御功能。针对部分植物广食性和专食性草食者的体外生测实验结果支持了白藜芦醇具有潜在的化学防御功能[25]。针对虎杖提取物的研究也显示，白藜芦醇具有一定的抗氧化作用[21]；但白藜芦醇在植物体内是否具有防御草食者的作用需要进一步深入研究。虎杖是IUCN认为的全球100种最具威胁性入侵种之一，已在欧洲和北美洲带来了巨大的生态灾难[48]。有同质园实验结果表明，不同来源地间不同基因型虎杖芪类次生代谢物的种类和含量有显著变化[20,49]，并且进一步通过化感作用对邻体物种产生负面影响[50]，这可能是虎杖在引种后快速进化形成“新武器”的表现。因此，全面剖析虎杖次生代谢物的生态功能及其影响因素，不仅有助于在理论上深入讨论植物化学防御与生物及非生物因子变化的关系，更对于解释虎杖入侵机制和生态系统恢复有着重要的实际意义。

本研究测定了虎杖中重要活性物质白藜芦醇含量，同时测定了被广泛认为是化学防御物质的总单宁类物质含量，基于叶片实际被取食的情况衡量草食作用强度，结合气候、太阳辐射和土壤因子数据，旨在探索虎杖次生代谢物纬度变异及其影响因素的相对重要性，探究虎杖次生代谢物质生态功能。虎杖的化学防御物质种类仍然没有一直的结论[21,50-51]，本研究通过首次对虎杖种群的大范围野外调查，发现其叶片酚类次生代谢物质的含量是以温度季节性为主的多种环境因子综合影响结果，暗示不同次生代谢物质可能具有多种不同的生态功能。白藜芦醇含量与虎杖叶片草食作用程度显著负相关，说明其可能是虎杖的化学防御性状，有待于后续深入研究。作为我国重要的传统药用植物，针对虎杖次生代谢物质的研究不仅加深了对植物次生代谢物质的纬度变异格局与影响因素的认识，也对于虎杖资源的开发利用具有一定的参考价值。