Illumina高通量测序分析百合内生真菌群落多样性

王安萍，冯关萍，曾建忠，殷帅文,2

Illumina高通量测序分析百合内生真菌群落多样性

王安萍1，冯关萍1，曾建忠1，*殷帅文1,2

（1. 井冈山大学生命科学学院，江西，吉安 343009；2. 江西省生物多样性与生态工程重点实验室，江西，吉安 343009）

百合具有较高的药用食用价值，研究发现它的许多内生菌代谢产物有进一步开发利用的潜能，深入了解百合内生真菌群落结构与多样性，有助于发现新菌种以及具有特定功能的内生菌代谢产物。以ITS区的rDNA为靶标序列，采用Illumina MiSeq测序技术分别对百合叶片（bhy417)、百合茎秆（bhj417）和百合地下鳞茎（bhl417）三个样品的内生真菌群落结构组成和多样性进行测定分析。经过分析有以下结果：三个样品共得到用于后续样品分析的436394条有效序列和122205709个碱基；样品bhy417的内生真菌群落丰富度最大；三个样品之间的内生真菌群落多样性差异不显著、群落结构不同；球腔菌属Mycosphaerella、外囊菌属Taphrina、炭疽菌属Colletotrichum、散斑壳属Lophodermium、壳二孢属Ascochyta、Zymoseptoria属、Catenulostroma属、Phaeophleospora属、Endoconidiophora属、Hormonema属、乌氏霉属Uwebraunia、Capnobotrylla属、丛赤壳属Neonectria、长毛盘菌属Trichophaea等在样品中丰度较高。FUNGuild功能预测结果显示，百合内生真菌包括以下功能菌群：植物病原菌、动物病原菌、腐生菌、未定义腐生菌、内生菌、木材腐生菌、地衣寄生菌等。研究结果表明百合有丰富的内生真菌定殖，其中的植物病原菌以及一些目前还未鉴定出来的菌将可能对百合生防菌以及具特定功能代谢产物的研发提供帮助。

百合；内生真菌；高通量测序；群落结构

百合最初载于《神农本草经》，卷丹百合是百合其中的一个品种，是多年生草本宿根植物，其鳞茎可作为蔬菜食用与药用植物栽培，其花芳香美丽，属于名贵的观赏花卉，百合可预防和治疗肺结核、神经衰弱、便秘、更年期综合症、痛风等症[1-2]。植物内生菌是存在于植物器官组织内部的一类微生物，对寄主植物不产生明显致病性，其发酵次生代谢产物具有多种生物活性。目前国内外开展的百合内生菌的实验有抗菌活性菌株的筛选鉴定、引起百合植物病害病原菌的分离等，已报道的百合内生真菌有孟璐等报道的尖孢镰刀菌[3]、李润根等报道的假短孢弯孢和高粱附球菌[4-5]等等。有研究表明通过纯培养获得的微生物种类以及数量都很有限，只占非纯培养微生物总数的0.1% ～ 10%，内转录间隔区（ITS）是研究真菌的最常用的测序靶点，能较真实反映真菌群落结构与多样性[6]。本研究以江西莲花种植卷丹百合的百合叶、百合鳞茎、百合梗茎为材料，采用Illumina测序技术对以上三个样品的内生真菌进行ITS 扩增子测序。通过深入研究百合内生真菌群落组成与多样性[7]，有助于更全面了解和鉴定百合内生真菌，也为今后研制开发百合病虫害生防菌和具实际应用生物活性功能菌等提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

本研究所采用的三个样品为百合叶片、百合地下鳞茎、百合茎秆，分别记为bhy417、bhl417、bhj417，样品连带泥土一起采集到实验室备用。百合材料是从江西莲花百合基地随机采摘的无病害植株，江西莲花县位于江西省西部，属亚热带季风湿润气候，年平均气温17.5℃，无霜期平均284 d，平均降雨量1600 ～ 1700 mm，年平均日照为1697.4 h，气候条件适合喜温作物的栽培。

1.2 实验方法

1.2.1 基因组DNA提取、PCR扩增及检测

各个样品依次使用70%乙醇溶液进行表面冲洗3遍，再使用1XPBS溶液冲洗3遍，晾干后用无菌的剪刀剪碎，再放入2 mL离心管中，加入适量钢珠和裂解液，在组织破碎仪上进行破碎。经过组织破碎仪破碎后，根据提取试剂盒操作说明书提取样品总DNA。样品提取DNA后利用Illumina Miseq软件进行ITS文库构建和高通量测序。即以提取出来的总DNA为模板，利用真菌引物ITS1F (CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA)和ITS2R (GCTGCGTTCTTCATCGATGC)对样品基因组DNA的ITS1-ITS2区进行PCR扩增，将所得的PCR产物混合后经过Tris_HCl洗脱和2%琼脂糖凝胶电泳检测目的片段大小和完整性，并进一步进行精确定量和处理[8]。

1.2.2 测序数据处理与统计分析

利用Illumina Miseq得到的原始数据文件经碱基识别分析转化为原始测序序列。由于下机测序得到的是双端序列数据，且测序序列中含有标签序列，以及测序时加入的引物和接头序列，所以首先需要去除引物接头，使用Cutadapt软件去除测序引物接头序列TGGAATTCTCGGGTGCCAAGGAACTC，再根据PE序列之间的重叠关系，使用PEAR软件将成对的序列拼接成一条序列。根据各样本标签序列和引物序列，从拼接后数据中分割出各样本数据，并校正序列方向，使用PRINSEQ软件切除序列尾部质量值20 bp以下的碱基，设置10 bp的窗口，如果窗口内的平均质量值低于20 bp，从窗口开始截去后端碱基，过滤质控后的含N序列和短序列，最终过滤掉低复杂度的序列。

利用Usearch 软件平台在上述优化序列中提取非重复序列，所有样本去冗余序列合并后去除没有重复的单序列，按照97%相似性对非重复序列 (不含单序列) 进行OTU聚类。采用RDP classifier贝叶斯算法对97%相似度水平的OTU代表序列进行分类学分析，在域、界、门、纲、目、科、属、种各个分类学水平上进行每个样本群落组成的统计，并使用SINTAX比对Unite数据库，以得到每个OTU对应的物种分类信息。采用Mothur软件计算Alpha多样性指数，以Shannon指数和Simpson指数反映百合内生真菌群落的多样性，以Chao1、Ace指数反映百合内生真菌群落的丰富度；采用R语言工具绘制PCA分析图进行Beta多样性分析；通过比对FUNGuild数据库，分析百合内生真菌功能类群[9-10]。

2 结果与分析

2.1 测序结果与Alpha多样性分析

经过分析共得到436394条有效序列和122205709个碱基，其中样品bhj417得到117059条序列和35408781个碱基，样品bhl417得到130431条序列和37043601个碱基，样品bhy417得到188904条序列和49753327个碱基，所有序列的长度均在101-452bp之间。将得到的所有有效序列进行聚类处理和Alpha多样性分析，得到结果如表1。

表1 三个样品内生真菌群落alpha多样性指数表（OTU水平）

Table 1 Alpha diversity index of endophytic fungi of three sample

Sample groupsNumberOTUsShannonSimpsonChao1AceCoverage bhj41711041418203.810.241849.051841.210.999348 bhl41712492917093.660.141754.241747.640.999152 bhy41718248818343.630.131956.891931.730.998838

Alpha多样性可以反映微生物群落的丰富度和多样性两方面。OTUs表示实际观测值；Number是有注释信息的OTU数目；Coverage指各样品文库的覆盖率；Chao1是估计样本中所含OTU数目的指数，Ace指数可估计样品的物种丰富度，其中Chao1和Ace指数的数值越大，表示群落丰富度越高；Simpson指数代表一个区域的生物多样性，它的值越大，说明群落多样性越低；Shannon常用于反映群落Alpha多样性，数值越大，说明群落多样性越高。根据表1可知，3个样品的测序覆盖率（Coverage）均大于99.8%，表明测序数据基本覆盖了3个样品中所有内生真菌的生物信息；Ace和Chao1指数结果显示，3个样品的内生真菌群落丰富度稍有差异，大小依次为：bhy417>bhj417> bhl417；但Shannon和Simpson指数表明不存在显著性差异，即样品间的内生真菌群落多样性大小差异不显著。

另外利用各样本在不同测序深度的序列进行随机抽样，以抽到的序列数与它们对应的OTU数目来构建稀释性曲线，以统计这些序列对应样本的Alpha多样性指数。图1中，以抽取的数据量为横轴，以Alpha多样性指数值为纵轴绘制曲线，图中曲线逐渐趋于平坦，表示测序数据量合理[11]。

图1 Alpha指数稀释性曲线图

图2 属水平百合内生真菌群落主成分分析

2.2 Beta多样性分析

Beta多样性分析主要是分析不同样本之间群落结构的相似性。通过在属水平上对上述三个样品的内生真菌群落结构进行主成分分析，来观察本次样本间的差异程度及差异变化规律。图2显示，PC1和PC2对样品群落的贡献率分别为82.26%和17.74%，是样品内生真菌群落结构的主要影响因素，且PC1的影响明显大于PC2。3个品种的样品点分开明显，表明内生真菌群落结构存在一定的差异性。在PC1的作用下，样品bhy417点与其他二个品种点拉开距离，PC1是bhy417内生真菌群落的主要影响因素，在PC2的作用下，样品bhl417和样品bhj417样品点间拉开距离，PC2是形成样品bhl417和样品bhj417内生真菌群落差异性的主要因素。Beta多样性分析表明了本次三个样本之间真菌群落结构具有明显差异。

2.3 各样品内生真菌组成分析

图3是bhy417、bhj417、bhl417组样品在门水平上的真菌群落组成柱形图，其中除了部分没有注释信息的unclasssified组，Ascomycota群落是各个样品中有注释信息真菌群落中最大的类群，其次是Basidiomycota群落。而三个样品相比，Ascomycota在bhy417样品中丰度最高（52.61%），在bhj417样品中最低（11%）；Basidiomycota在bhl417样品中丰度最高（3.35%），在bhy417样品中减少到2.08%，在bhj417样品中最低（1.18%）。

表2展示的是基于属水平上不同样品中的真菌菌属结果。由表2可知，属水平上三个样品内生真菌群落间差异明显，优势菌落各不相同，这和上述研究对三个样品进行内生真菌群落Beta多样性分析结果一致。其中，bhl417样品中属水平上被鉴定出的有炭疽菌属（13.90%）、土赤壳属（5.07%）、外瓶霉属（1.10%），77未被鉴定出的有丛赤壳科的一种真（6.15%）、火丝菌科的一种真菌（4.46%）、角担菌科的一种真菌（2.67%）；bhy417样品中属水平上被鉴定出来的有属（1.23%），这是属水平上未被鉴定出的有座囊菌目的一种真菌（31.90%）子囊菌门的一种真菌（9.17%）球腔菌科的一种真菌（2.12%）；样品bhj417属水平上未鉴定出，只鉴定出子囊菌门的一种真菌（4.08%）和腔菌目的一种真菌（3.63%）。

（Unclassified_Fungi：没有注释信息的类群；Other：丰度较低的类群）

从表2中还可以看出，在3份样品中，属水平上样品bhl417能被检测出来的属种类更多，其中炭疽菌属丰度占比达到13.90%，三个样品中丰度占比分别为bhj417（87.8%）、bhl417（64.6%）、bhy417（44.99%），因此，虽然结果还需要后续加大样本量和重复实验以进一步验证，但我们知道百合中还有很多未知真菌以及它们的代谢产物功能可以探讨研究，百合内生真菌的丰富性以及可研究空间还很大。

2.4 内生真菌FUNGuild功能预测

通过比对FUNGuid( Fungi Functional Guild)数据库可以对真菌群落进行分类分析，从而了解和预测内生真菌群落功能。FUNGuild首先根据真菌的营养方式将真菌分为三大类：病理营养型(pathotroph)；共生营养型(symbiotroph)；腐生营养型(saprotroph)。基于3大营养方式，又进一步细分为若干个guilds(guilds是微生态学中的概念)：动物病原菌、丛枝菌根真菌、外生菌根真菌、杜鹃花类菌根真菌、叶内生真菌、地衣寄生真菌、地衣共生真菌、菌寄生真菌、植物病原菌、未定义根内生真菌、未定义腐生真菌和木质腐生真菌等。

表2 不同样品内生真菌优势种群分布（基于属的水平）

Table 2 Distribution of dominant fungi from different sample based on the classification level of genus

SampleGenusPer(%) bhl417Colletotrichum13.9 Exophiala1.1 Ilyonectria5.07 unclassfied_Nectriaceae6.15 unclassfied_Pyronemataceae4.46 unclassfied_Ceratobasidiaceae2.67 unclassfied_Fungi64.6 Other2.04 bhy417Capnobotryella1.23 unclassfied_Dothideales31.9 unclassfied_Ascomycota9.17 unclassfied_Mycosphaerellaceae2.12 unclassfied_Fungi44.99 Other10.59 bhj417unclassfied_Ascomycota4.08 unclassfied_Pleosporales3.63 unclassfied_Fungi87.8 Other4.49

本次FUNGuild 功能预测置信水平仅选用probable和highly probable，以保证预测的准确性。比对预测结果显示：本次三个样品中的真菌类群主要预测得到腐生营养型、病理营养型、共生营养型、病理-腐生营养型、病理-共生营养型、腐生-共生营养型、病理-腐生-共生营养型共7个营养型。不同的样品其主要营养型不同，样品bhj417和样品bhy417中，病理、腐生、病理-腐生3种营养型的相对丰富度较高，在二个样品中的相对丰富度总和分别达到80.72%和95.86%，而样品bhl417中，病理、共生、病理-共生3种营养型的相对丰富度较高，相对丰富度总和达到77.65%。

不同样品的主要生态功能群也存在显著差异，样品bhj417内生真菌功能类群主要是植物病原菌(30.21%)、未定义的腐生菌（41.99%）、内生真菌—植物病原菌（4.91%）、植物病原菌—未定义的腐生菌（2.58%），其中未定义腐生菌在属水平上包括属（1OTU）、属(3OTU)等，植物病原菌在属水平上包括球腔菌属（3OTU）、外囊菌属（4OTU）等，内生真菌—植物病原菌有炭疽菌属（1OTU）等，植物病原菌—未定义的腐生菌在科水平上主要属于球腔菌科（3OTU）。样品bhy417内生真菌功能类群中植物病原菌相对丰度高达67.81%，是bhy417中最主要的功能类群，在科水平上主要有核盘菌科（1OTU），另有球腔菌属（4OTU）、外囊菌属（5OTU）、散斑壳属（6OTU）、壳二孢属（2OTU）以及一些新属种属（1OTU）、属（2OTU）、属（1OTU）、属（1OTU）等；样品bhy417中，未定义腐生菌类群也是样品bhy417内生真菌主要功能类群，相对丰度达18.18%，其在属水平上包括属（1OTU）、乌氏霉属（2OTU）、属(3OTU)等以及只在样品bhy417中检测到的双毛座孢属（1OTU）、属（1OTU）、黑孢霉属（1OTU）、隐盘芹属（1OTU）等。样品bhl417内生真菌功能类群主要是内生真菌—植物病原菌（相对丰度为53.44%）、植物病原菌（相对丰度为23.91%），动物病原菌—未定义腐生（4.22%）、丛枝菌根(0.40%)等，其中丛枝菌根共7个OTU，占样品bhl417总OTU数量的18.92%，属水平上有炭疽菌属（1OTU）、丛赤壳属（1OTU）、长毛盘菌属（1OTU）、外瓶霉属（3OTU）、根生孢子属（2OTU）、马利亚霉属（1OTU）、斑替支孢瓶霉属（1OTU）等。

3 讨论与小结

3.1 Illumina高通量测序研究百合内生真菌的可行性

利用高通量测序技术研究百合内生真菌，是目前国内外检测生物信息量和内生真菌群落结构完整性最大的保证限度。本研究利用Illumina高通量测序技术研究百合内生真菌，共获得了ITS1-ITS2 区436394条有效序列以及196个置信水平选用probable和highly probable的OTU，涵盖了189个真菌属，其中包括很多不确定的新属种，证实了百合中有数量和种类都丰富的内生真菌以及Illumina高通量测序技术研究百合内生真菌的可行性。

3.2 百合样品内生真菌群落差异及群落功能

此次研究中百合内生真菌能被鉴定出来的主要有炭疽菌属、土赤壳属、外瓶霉属、丛赤壳属、球腔菌属以及未经分类的核盘菌科、火丝菌科、角担菌科、球腔菌科，不同样品的主要菌群差异明显。另外本次FUNGuild功能预测结果表明，百合内生真菌大部分都被定义为植物病原菌、未定义腐生菌、内生菌-植物病原菌等类群，病原菌与腐生菌类群丰度较高表明了较多病原菌和腐生菌寄生于百合内，在健康百合植株中以内生菌方式在植物体内生长，不会引起寄主引起病害症状，但当条件适当时可能会变成病原菌而使寄主发生病害或腐变[12]。炭疽菌属中的百合炭疽病就是其中一种植物病原菌，本研究中发现其在百合叶片、百合茎秆、百合地下鳞茎中以病理-共生的营养方式都有分布，其中百合地下鳞茎bhl417样品内百合炭疽菌丰度特别高，且是bhl417所有可鉴定内生真菌中分布最多的菌属，百合鳞茎中百合炭疽菌的高丰度表明百合地下鳞茎受百合炭疽病田间病害很大，鳞茎在储藏过程中可发病引致鳞片变黑干缩，造成较大的经济损失，应加速抗炭疽病资源筛选及抗病优良品种选育工作、开发适合大田生产的生防微生物[13]；土赤壳属是从广义的新丛赤壳属中独立出来的，广泛分布在木本和草本植物的根内以及土壤中，属于腐生真菌或弱寄生真菌，该属大多数种类为植物病原菌，可引起植物根腐病和黑腐病等[14]，本研究发现其在百合地下鳞茎中大量存在；散斑壳属能引起植物黑皮病，有研究发现茉莉酸甲酯对由于散斑壳属真菌造成的黑皮病有响应[15]。

我们总结分析本次研究，还发现百合中有潜在有益内生真菌，外瓶霉属（）真菌是矿区特殊生境中的优势类群，它们在矿区植物根部具有较高的定殖率。通过一定的筛选技术对外瓶霉菌株进行重金属抗性筛选，能得到部分重金属高抗菌株和敏感菌株[16-17]；丛赤壳属菌株发酵产物初提物对烟曲霉菌具有抑制活性和一定的抗稻瘟霉活性[18]；球腔菌属菌株具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的次生代谢产物[19]；角担菌科的真菌中提取的凝集素对菜青虫有影响[20]；火丝菌科、核盘菌科、属的真菌在百合中的功能还有待于进一步的研究探究。

[1] 张瑞贤,张卫,刘更生.神农本草经译释[M].上海:上海科学技术出版社, 2018: 324.

[2] 游力刚,井亚莉. 卷丹百合的功效及高产栽培技术[J]. 吉林蔬菜,2008(6):67-68.

[3] 孟璐,周剑忠,等. 百合内生真菌中抗茵活性菌株的筛选与鉴定[J].江苏农业科学,2012,40(6): 242-244.

[4] 尹乐斌,李立才,孟庆霞,等.龙牙百合腐败菌的分离鉴定、生物学特性及抑制剂筛选[J].食品与机械,2019,35(6):79-84.

[5] 李润根,卢其能,何咪,等.百合新病原菌假短孢弯孢生物学特性及其对杀菌剂的敏感性[J].植物保护,2020,46(6): 41-46.

[6] 谢红炼,汪汉成,等.烟草种子内生真菌群落结构和多样性分析[J].中国烟草科学,2021,42(2): 28-36.

[7] 文永均,黄璜,马中刚,等. Illumina高通量测序分析健康三七与患根腐病三七根际土和根内生真菌多样性[J].食品与发酵科技,2020,56(6): 23-30.

[8] 尹丽,刘仁绿,廖永辉,等.铝胁迫对酸性红壤古菌amoA基因多样性的影响分析[J].井冈山大学学报:自然科学版,2021,42(4):53-58.

[9] McMurdie PJ, Holmes S. phyloseq: an R package for reproducible interactive analysis and graphics of microbiome census data[J].PLoS One,2013, 8(4):e61217.

[10] Nguyen N H, et al. FUNGuild: an open annotation tool for parsing fungal community datasets by ecological guild[J]. Fungal Ecology,2016,20(1):241-248.

[11] 卢美西. 蛇纹石矿区微生物群落特征及其固碳作用潜力[D].南京:南京师范大学, 2020.

[12] 姜道宏.植物内生真菌及其展望[J].中国生物防治学报, 2015, 31(50): 742-749.

[13] 程维舜,祝菊红,蔡翔,阳永学,等.百合炭疽病研究进展[J].中国植保导刊,2020,40(2): 33-36.

[14] 王玉君,张丽春,郭顺星.土赤壳属三个中国新记录种[J].菌物学报,2015,34(6):1209-1214.

[15] Šņepste Ilze,Krivmane Baiba,Šķipars Vilnis,et al. Induction of defense responses in pinus sylvestris seedlings by methyl lasmonate and response to heterobasidion annosum and lophodermium seditiosum inoculation[J]. Forests,2021,12(5):628-628.

[16] 刁玉华.深色有隔内生真菌(DSE)抗锌菌株的筛选及其抗性机理的初步研究[D]昆明:云南大学,2012.

[17] DiaoYu-Hua ,Li Tao ,Zhao Zhi-Wei. Zinc accumulation characteristics of two exophiala strains and their antioxidant response to Zn2+stress[J].Journal of Environmental Protection, 2013,4(4A):12-19.

[18] 唐潮,叶科元,方莎莎,等.北极真菌Nectria sp.B-13中酚醛倍半萜烯类化合物的研究[J].中国海洋药物,2016,35(5): 35-39.

[19] Qiu Pei, Liu Zhaoming,Chen Yan, at al. Secondary metabolites with α-Glucosidase inhibitory activity from the mangrove fungus mycosphaerella sp.SYSU-DZG01[J] Marine Drugs, 2019, 17(8): 483-483.

[20] Alborzi Zeynab, Zibaee Arash, Sendi Jalal, et al. Effects of the agglutinins extracted from rhizoctonia solani(cantharellales:Ceratobasidiaceae)on pieris brassicae (lepidoptera: Pieridae)[J].Journal of Economic Entomology, 2016, 109(3): 1132-1140.

COMMUNITY DIVERSITY ANALYSIS OF ENDOPHYTIC FUNGI INBY ILLUMINA HIGH-THROUGHPUT SEQUENCING

WANG An-ping1, FENG Guan-ping1, ZENG Jian-zhong1,*YIN Shuai-wen1,2

（1.School of Life Sciences, Jinggangshan University, Ji’an, Jiangxi 343009, China;2. The Key Laboratory of Biodiversity and Ecological Engineering of Jiangxi Province, Ji’an, Jiangxi 343009, China）

has high medicinal and edible values, and many endophytic metabolites fromhave been found to have potential for further development and utilization. An in-depth understanding of the community structure and diversity of endophytic fungi fromcan help to discover new strains and endophytic metabolites with specific functions. Using the rDNA of ITS region was as the target sequence, Illumina Miseq sequencing technology was used to determine the community structure and diversity of endophytic fungi in lily leaf (bhy417), stem (bhj417) and bulb (bhl417). The results showed that a total of 436394 effective sequences and 122205709 bases were obtained from the three samples for subsequent analysis; The endophytic fungi community richness of sample bhy417 was the highest; There was no significant difference in the diversity of endophytic fungi community among the three samples, but the community structure was different;,,,,,,,,,,,,,was more abundant in the samples. The FUNGuild function prediction analysis showed that the endophytic fungi inincluded the following functional groups: plant pathogens, animal pathogens, saprophytes, undefined saprophytes, endophytes, wood saprophytes, lichen parasites and so on. The results indicated there were abundant endophytic fungi colonized in, and among which plant pathogens and some unknown bacteria will provide some reference value for the research and development of biocontrol bacteria and specific functional metabolites of.

; endophytic fungi; high-throughput sequencing; community structure

1674-8085（2022）04-0030-07

Q93-331；S644.1

A

10.3969/j.issn.1674-8085.2022.04.005

2021-11-27；

2022-04-16

国家自然科学基金项目(31260076，31760332)

王安萍(1971-），女，江西吉安人，实验师，硕士，主要从事天然产物研究与开发(E-mail: jskwangap@126.com)；

*殷帅文(1978-)，男，湖南宁乡人，副教授，博士，主要从事天然产物研究与开发(E-mail: shwyin@126.com).