不同盐度水平对金钱鱼幼鱼鳃线粒体丰富细胞结构的影响

刘鉴毅，余焱方，冯广朋，赵 峰，孙雪娜，王 妤，邹 雄，黄晓荣，李 琪，孙艳秋

（1.中国水产科学研究院东海水产研究所，上海 200090；2.水产科学国家级实验教学示范中心，上海海洋大学，上海 201306；3.农业农村部东海与长江口渔业资源环境科学观测实验站，上海 200090）

广盐性硬骨鱼类为了适应外界环境盐度骤变，通过调节鳃丝上皮中线粒体丰富细胞数量、分布、形态结构改变，不同亚型之间通过可逆性的转变进行渗透调节，以维持内外环境稳定［1］。一般与鱼类渗透调节相关的生理生化研究，主要涉及鳃和肾脏等渗透调节器官的组织形态变化，研究指标包括Na＋／K＋-ATPase活性、血清（浆）的渗透压、离子浓度和激素浓度的变化［2］。鳃是硬骨鱼类进行渗透调节的重要器官，具有维持内外渗透平衡、离子的分泌和吸收、pH以及排泄氨氮等功能［3-4］。

水环境盐度的改变会破坏鱼体内环境的稳态，不仅会造成组织器官损坏、渗透条件功能丧失，而且会影响其存活和生长［5-6］，在不同盐度海水环境下鳃线粒体丰富细胞主要发挥离子吸收和离子分泌的作用，在低渗条件下向外界分泌氯离子（Cl-），高渗条件下分泌和吸收钠离子（Na＋）、钾离子（K＋）的离子双向转运功能，其数量和形态大小会因外界盐度变化而发生相应改变［7］，以此适应外界水环境盐度的变化，在鱼类渗透压调节中起到重要的作用。

金钱鱼（Scatophagus argus），也称金鼓鱼，隶属于鲈形目，广泛分布于印度-太平洋水域，属于广盐性亚热带硬骨鱼类，在渗透调节方面具有很强的适应性［8］。目前有关金钱鱼渗透调节方面的研究报道主要涉及盐度渗透相关基因的表达分析［9-10］、基因的克隆与表达［11］、抗氧化作用的相关研究［12］，而盐度对金钱鱼的组织学研究报道较少。本实验采用普通光学显微镜和透射电子显微镜，观察金钱鱼幼鱼在不同盐度梯度下鳃线粒体丰富细胞的形态结构变化，比较分析鳃线粒体丰富细胞在盐度适应过程中的变化规律，以期为阐明鱼类鳃的结构特征与其盐度适应调节关系提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验用鱼

实验用鱼为中国水产科学研究院东海水产研究所海南琼海研究中心人工繁殖的金钱鱼幼鱼，选择规格为（4.68±0.09）cm、（6.31±0.25）g的健康幼鱼空运至东海水产研究所福建福鼎研究中心，暂养于基地水池中，周期30 d。

1.2 实验设计

实验暂养期间温度为（22±0.5）℃，pH7.8～8.1，氨氮（0.10±0.02）mg·L-1、溶氧大于6.5 mg·L-1。实验设置盐度梯度为0、5、10、20、30、35，以当地自然海水（盐度20）为对照组，通过向淡水中加入不同比例的海水晶调制成盐度5、10、30、35。实验每组设置3个平行，每个平行30尾鱼，饲养于直径80 cm、高72 cm的塑料水槽中，24 h不间断充气，每天换水三分之一，并于早晚各喂食1次，投喂饲料为鱼体质量的1%，投喂1 h后吸污。开始实验30 d后取样，实验期间无死亡。

1.3 样品采集

从各水槽内随机选取3尾幼鱼，于冰盘上解剖，采集左侧第二鳃弓鳃丝。

光镜样品用波恩溶液保存，固定24 h，经流水冲洗，在Lecia TP 1020脱水机下进行乙醇梯度脱水（脱水梯度：0%、80%、95%、100%），石蜡包埋，Lecia RM 2135切片机超薄切片，切片厚度为4～5μm。经苏木精-伊红染色，中性树胶封片后，在Axio Scope·A1型光学显微镜观察并进行显微拍照。

电镜样品用戊二醛试剂固定，4℃下固定一周，0.1 mg·L-1的PBS室温冲洗3次，1%锇溶液固定l h，进行乙醇梯度脱水（脱水梯度：30%、50%、70%、80%、90%、100%），分离鳃弓中部的鳃丝，Epon812渗透和包埋，ULTRACUTE超薄切片机切片，采用醋酸铀-柠檬酸铅双染的常规电镜切片染色，日立（JSM 5610）透射电镜观察、拍照。

1.4 实验数据测量与统计分析

将光学显微镜拍照所得照片用Imager proplus 6.0软件校准后，测量金钱鱼不同组别鳃丝上的初级鳃小片直径和次级鳃小片直径，在相同部位随机测量6组数据，然后取平均值。

实验测得数据（SD±SEM）在SPSS 24软件上进行单因子方差分析（ANOVA），并进行Duncan多重比较法检验组间差异（P＝0.05），将所得结果用EXCEL 2016制作成表格进行分析。

2 结果与分析

2.1 不同盐度下金钱鱼幼鱼鳃的显微结构

在光学显微镜下，线粒体丰富细胞、粘液细胞以及扁平上皮细胞均分布在鳃小片和鳃丝上（图1），通过HE染色，每种细胞的细胞质均被伊红染成浅红色，细胞核被苏木素染成蓝色。

淡水条件下，线粒体丰富细胞主要分布在初级鳃小片基部，细胞着色较深，初级鳃小片直径（57.350±9.114）μm显著小于对照组（75.367±8.429）μm（P＜0.05）（表1），次级鳃小片直径（8.850±2.057）μm与对照组（7.817±1.298）μm差异不大。粘液细胞主要分布在细胞外软骨质中，血细胞数量较少（图1-a）。

表1 不同盐度下金钱鱼鳃小片直径的变化Tab.1 Changes of gill lamella diameter of juvenile Scatophagus argus under different salinities

盐度5组线粒体丰富细胞主要分布在次级鳃小片基部。初级鳃小片直径（71.600±3.543）μm与对照组（75.367±8.429）μm差异不大，次级鳃小片直径（11.750±1.388）μm显著大于对照组（7.817±1.298）μm（P＜0.05）（表1），故次级鳃小片呈膨胀状态，膨大光圈（图1-c）。粘液细胞数量明显增加，软骨细胞可见于细胞外软骨质中，其软骨质间隔较淡水组明显增大，血细胞由初级鳃小片向次级鳃小片顶端蔓延，细胞呈圆形（图1-b）。

图1 不同盐度下金钱鱼幼鱼鳃的显微结构图Fig.1 Microstructure of gills of juvenile Scatophagus argus under different salinity groups

盐度10组线粒体丰富细胞分布于次级鳃小片上，以及次级鳃小片基部。初级鳃小片直径（92.050±9.408）μm显著大于对照组（75.367±8.429）μm（P＜0.05），基部明显膨大（表1），次级鳃小片直径（9.500±1.562）μm与对照组（7.817±1.298）μm差异不大，粘液细胞数量增加，分布广泛（图1-d）。

盐度20组（对照组）线粒体丰富细胞主要位于初级鳃小片上。血细胞主要位于次级鳃小片上，排列紧密，少量见于细胞外软骨质中，粘液细胞主要分布在初级鳃小片上（图1-e）。

盐度30组线粒体丰富细胞主要分布在初级鳃小片上，以及次级鳃小片基部，初级鳃小片直径（61.167±6.364）μm 和次级鳃小片直径（6.830±1.405）μm均显著小于对照组的初级鳃小片直径（75.367±8.429）μm和次级鳃小片直径（7.817±1.298）μm（P＜0.05），细胞着色较深，次级鳃小片轮廓模糊，边界处细胞增生，软骨细胞数量较多（图1-f）。

盐度35组线粒体丰富细胞主要分布在初级鳃小片上，数量明显增加，且细胞着色较深。初级鳃小片直径和次级鳃小片直径与对照组差异不大，鳃丝形态最接近于对照组。鳃丝细长向外围延伸，血细胞均匀排列分布在次级鳃小片上，粘液细胞数量较少（图1-g）。

2.2 不同盐度下金钱鱼幼鱼鳃的超微结构

淡水条件下，线粒体丰富细胞多为椭圆形，数量较少，多与支持细胞相邻分布，大部分线粒体丰富细胞无法直接观察到细胞核，胞质内线粒体密集，具珠泡结构，不具顶端开口（图2-a）。

盐度5组线粒体丰富细胞大多为椭圆形，分为不具顶端开口和具顶端开口两种形态，细胞膜内陷形成顶隐小窝，其中具顶端开口的线粒体丰富细胞具有两种开口模式：1）顶端开口较浅，顶端突起程度较小，为突起型（Ⅰ型）；2）顶端开口较深，开口内部具有凸起的顶膜结构，细胞之间紧密连接，开口处有微脊结构出现，为凹陷型（Ⅱ型）（图2-b）。

盐度10组线粒体丰富细胞多呈圆形，核基位，胞核形状规则呈圆形，且体积较大，细胞之间紧密连接，两两相邻，相邻细胞之间具有较大的孔洞结构，顶端开口较小，且顶膜平滑，与盐度5组有较大差别，胞质内线粒体数量较多，密度大（图2-c）。

盐度20组（对照组）线粒体丰富细胞多呈椭圆形，胞核呈椭圆形，核基位，胞质内线粒体数量较少，密度低，多与其他辅助细胞相邻，形成多细胞复合体结构，与其他组别不同的是，盐度20组具有发达的柱状微绒毛结构（图2-d）。

盐度30组线粒体丰富细胞呈溶解状，胞核呈圆形，核基位，胞质内线粒体分布零散，具发达的微细小管系统和囊管细胞，线粒体丰富细胞具多个顶端开口，且开口较大，具有凸起的顶膜结构，细胞开放基本与外界直接接触，为深洞型（Ⅲ型）（图2-e）。

盐度35组线粒体丰富细胞体积较大，呈扁平状，胞核呈椭圆形，形态不规则，少数细胞核出现色素沉积反应，细胞之间紧密连接，具发达的管网结构（图2-f）。

图2 不同盐度下金钱鱼幼鱼鳃的超微结构图Fig.2 Ultrastructure of gills of juvenile Scatophagus argus under different salinity groups

3 讨论

硬骨鱼类鳃的主要功能是运输水和离子，当外界渗透压高于体内渗透压时，一般会通过吞饮海水、减少尿量防止水分流失，排出钠钾离子（Na＋、K＋）等方式维持渗透平衡；而外界渗透压低于体内渗透压时，一般通过增加尿量，从外界吸收钠离子（Na＋）、氯离子（Cl-），并且停止饮水等方式适应盐度改变［13-14］。鱼鳃上的线粒体丰富细胞会通过自身形态结构、各亚基之间结构的可逆性转变，以及细胞内的线粒体形态结构变化共同维持内外环境的渗透压平衡，以维持自身的生长平衡［11］。

3.1 不同盐度下金钱鱼幼鱼鳃的显微结构

本实验研究结果表明，淡水环境下金钱鱼幼鱼线粒体丰富细胞初级鳃小片直径显著小于对照组，盐度5组次级鳃小片直径显著大于对照组，且鳃丝部分膨大，盐度10组初级鳃小片直径显著大于对照组，说明低盐环境下，金钱鱼幼鱼鳃丝较宽，鳃小片宽且长，有利于鳃与外界水体环境的充分接触，通过吸收水体中的无机离子维持内环境稳定，这与中华鲟（Acipenser sinensis）幼鱼鳃［15-16］和红鳍东方鲀（Takifugu rubripes）幼鱼鳃［17］在低盐环境下的显微观察结果一致，也可能是由于代谢水平较低而通过增加排尿的方式保持盐 分［18-19］。吴 勇 等［20］研 究 发 现 细 鳞 鯻（Terapon jarbua）幼鱼在低盐胁迫下，出现明显吸水现象。本实验中金钱鱼幼鱼次级鳃小片会出现膨大的光圈结构，大大的增加了与外界水环境的接触面积，故为淡水适应性结构。

盐度30、35组次级鳃小片直径显著小于对照组（盐度20），但是鳃丝变得细长，随着盐度的升高，鳃小片宽度逐渐变小，说明在高盐环境下，金钱鱼幼鱼通过缩短次级鳃小片间距，以及改变鳃丝结构来排出盐分和吸收水分，并且线粒体丰富细胞数量也显著增加［21-23］，马慧等［24］的研究发现，高盐胁迫可能对鱼类的机体损伤程度较小，鱼体可以通过自身的渗透调节机制来适应外界的水体盐度变化，说明本实验中高盐度组的鳃丝形态与对照组最为相似。高盐环境下，次级鳃小片变得细长，有利于增大与外界的接触面积，线粒体丰富细胞数量明显增加，着色较深，说明其细胞内的线粒体数量较多，故为海水适应性结构。

3.2 不同盐度下金钱鱼幼鱼鳃的超微结构

金钱鱼幼鱼鳃线粒体丰富细胞随着盐度升高，顶膜开口凹陷程度增加，出现突起型（Ⅰ型）、凹陷型（Ⅱ型）和深洞型（Ⅲ型），不同于其他研究的是，淡水组和盐度35组未见明显顶膜开口，可能与FRIDMANS等［25］对尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）的研究结果类似，即存在一种Ⅰ型的过渡类型。赵峰等［26］研究发现，高盐条件下的中华鲟幼鱼鳃上皮顶膜开口为Ⅲ型的线粒体丰富细胞代替了低盐条件下顶膜开口为Ⅰ型的线粒体丰富细胞，利用这种形态结构的变化来适应高渗环境。故推测本文中盐度35组Ⅰ型的过渡类型线粒体丰富细胞代替高渗条件下Ⅲ型的线粒体丰富细胞，以此适应高渗环境。

淡水环境下金钱鱼幼鱼鳃线粒体丰富细胞多呈椭圆形，数量较少，随着盐度升高，细胞数量随之增加且分布越来越紧密，微嵴结构明显，盐度30组线粒体丰富细胞呈溶解状态，出现破裂脱落的现象，细胞核呈圆形，顶膜开口为深洞型（Ⅲ型），顶端小窝周围可见丰富囊管系统和微细小管系统，且与顶膜相连，外围微嵴结构丰富，细胞开放直接与外界水环境接触，造成线粒体丰富细胞的形态结构改变［27-29］。盐度上升至30后，Ⅲ型线粒体丰富细胞数量增加，故可推测Ⅲ型顶膜开口为海水型线粒体丰富细胞主要形态类型。本研究中顶膜开口为Ⅱ型和Ⅲ型线粒体丰富细胞通过增加与外界的接触面，从而吞饮海水，排出Na＋、K＋等离子，为离子排出型线粒体丰富细胞，顶膜开口为Ⅰ型的线粒体丰富细胞开口较小，从而减少水分流失，并且具有吸收钙离子（Ca2＋）的重要作用，为离子吸收型线粒体丰富细胞［30-32］。

本研究及之前研究结果显示，金钱鱼幼鱼在不同盐度条件下具有较强的适应性［33］，其在低盐环境下线粒体丰富细胞主要通过形态结构改变，分化出具不同顶端开口的线粒体丰富细胞；高盐环境下主要通过线粒体丰富细胞数量的增加，以及深洞型（Ⅲ型）的线粒体丰富细胞适应高渗环境。这种适应性结构的改变，有利于金钱鱼在不同盐度水体中生存，与金钱鱼具有较强的盐度适应性密切相关。