基于线粒体16S r RNA和COI序列的江苏启东海域4种贝类遗传多样性分析

闫永斌，葛玉双，程起群，范瑞良，李楠楠，全为民

（1.中国水产科学研究院东海水产研究所，上海 200090；2.上海海洋大学海洋科学学院，上海 201306）

贝类的种类极为丰富，具有重要的经济和生态价值，在渔业产业和生态修复中占有极为重要的地位。据统计，2017年贝类产量超过1 500万t，占水产品总量的23.7%［1］。日本镜蛤（Dosinia japonica）、四角蛤蜊（Mactra veneriformis）、西施舌（Coelomactra antiquata）、中 国 蛤 蜊（Mactra chinensis）隶属于软体动物门（Mollusca），双壳纲（Bivalvia），帘蛤目（Veneroida），主要分布在中国、韩国、朝鲜、日本以及俄罗斯远东海域，且分布区多有重叠［2-5］，这4种贝类都具有较高的营养价值和经济价值，尤以西施舌为贵。受过度捕捞等因素的影响，这4种贝类的野生种群状况堪忧：日本镜蛤和西施舌的资源量不断减少，呈现不断衰减的趋势；四角蛤蜊的产量也逐年下降［2，4］；中国蛤蜊由于野生种群的生存受到威胁，而养殖的蛤蜊幼苗依旧需要靠野外采捕得到，因此苗种的稀少也阻碍了中国蛤蜊增养殖业的发展［4］。除了经济价值外，贝类的生态价值也极其重要。贝类可通过降低水体中颗粒有机物（藻类和有机碎屑）的浓度，间接控制氮磷营养盐浓度，耦合水层-底栖环境，保护生物多样性和营造生物生境，并且承担了生态系统中的部分固碳功能，在水体生态系统修复中起到重要的作用［6-8］。

遗传多样性是指同一物种不同种群间、同一群体不同个体间遗传变异的总和，是物种和种群适应环境变化的重要物质基础，是生物多样性的重要组成部分［9-10］。贝类的遗传多样性，不仅反映其本身的资源状况，还会对水域生态系统结构和功能的变化产生影响。因此，开展贝类遗传多样性的调查研究，具有重要的意义。动物mtDNA具有母系遗传、进化速度快、结构简单、分子量小等特点，常被用于物种遗传多样性等领域的研究；其中的16SrRNA（16Sribosomal RNA）和COI（细胞色素氧化酶I亚基，cytochrome oxidase subunit I）基因是贝类遗传多样性领域中应用较广的分子标记［4，9-10］。

有关日本镜蛤、四角蛤蜊、西施舌和中国蛤蜊等4种贝类的研究，主要集中在生殖发育、繁殖生物学、生药学、增养殖技术等方面［4，11-12］；染色体核型分析、重金属积累、寄生虫病、免疫等方面的研究也有若干报道［4，13］。而涉及遗传多样性的文献较少，仅见国内有若干关于四角蛤蜊、西施舌和中国蛤蜊的研究［3-4，9-14］。本研究通过PCR扩增并测序启东海域的日本镜蛤、四角蛤蜊、西施舌和中国蛤蜊等4种贝类的16S rRNA和COI基因片段，调查分析其遗传多样性状况，以期为启东海域贝类种质资源的管理、保护和监测提供参考依据，进而为精准制定相关的管理和保护措施提供科学数据支撑。

1 材料与方法

1.1 实验材料

2019年8月6—14日，在江苏省启东海域（31°39.616′～32°08.474′N、121°44.742′～122°09.980′E）设置27个采样点，以采集各种贝类样本，其中包括日本镜蛤、四角蛤蜊、中国蛤蜊和西施舌样本共2 031只。样本取回后，放置在-20℃冷冻保存备用。

1.2 基因组DNA的提取

从所采集的2 031只贝类样本中，随机选取日本镜蛤、四角蛤蜊、中国蛤蜊和西施舌样品各30只（以各物种中文名称的首字母作为编号，分别编号为：R1～R30、S1～S30、Z1～Z30、X1～X30）。取闭壳肌组织；用海洋动物组织基因组DNA试剂盒（天根公司）提取基因组DNA，-20℃保存备用。提取步骤按照试剂盒说明书操作。

1.3 线粒体16Sr RNA和COI基因序列的PCR扩增与测序

分别用通用引物或自行设计的引物，对4种贝类的16SrRNA和COI基因进行PCR扩增，引物信息见表1。由于COI通用引物对西施舌样本的扩增效果不佳，故西施舌COI标记的扩增引物需自行设计（在NCBI网站下载1条西施舌线粒体COI基因序列，序列号为FJ653656.1，然后基于该基因两端的保守序列，利用软件Primer Premier 6设计、优化西施舌的COI扩增引物），引物在上海生工生物技术服务有限公司合成。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

PCR反应总体积为25μL，包括Taq酶预混液12.5μL，正反引物各1μL，DNA模板3μL，双蒸水7.5μL。PCR扩增程序见表2。

表2 PCR扩增程序Tab.2 PCR amplification program

PCR产物在1%琼脂糖凝胶中电泳，溴化乙锭（ethidium bromide，EB）染色，凝胶成像系统检测。扩增产物送至上海生工生物技术服务有限公司进行双向测序，测序引物与PCR引物相同。

1.4 数据分析

通过ClustalX（Version1.83）［17］软件进行多序列比对和分析，采用MEGA X［18］软件确定各序列的碱基组成、多态位点及个体间遗传距离等。采用DNASP v5.0［19］软件计算单倍型个数（H），单倍型多样性（Hd），核苷酸多样性（Pi）和平均核苷酸差异数（k）等遗传多样性参数。

2 结果与分析

2.1 PCR扩增结果

日本镜蛤、四角蛤蜊、中国蛤蜊和西施舌4种贝类的PCR扩增电泳图见图1。结果显示，4种贝类均可扩增出与预期片段大小一致的目的片段。其中16SrRNA长度均约为300 bp；而COI标记由于采用的引物不同，扩增出的片段长度有差异，日本镜蛤、四角蛤蜊和中国蛤蜊扩增长度均约为665 bp，而西施舌长度约为505 bp。

图1 线粒体标记PCR扩增电泳图Fig.1 PCR products of mtDNA genes

2.2 序列变异特征

绝大部分PCR产物测序结果良好，符合分析要求。最终用于分析的序列数分别为：1）16SrRNA基因标记：四角蛤蜊30条、中国蛤蜊30条、日本镜蛤29条、西施舌29条；2）COI基因标记：四角蛤蜊28条、中国蛤蜊29条、日本镜蛤30条、西施舌30条。平均碱基组成见表3。

由表3可知，4种贝类的16SrRNA和COI基因片段的碱基组成结构呈现出A＋T明显高于C＋G、且C的比例都是最低的特点，而两种基因片段不同之处在于碱基A和T比例的不同，在16SrRNA基因片段中A与T的比例相差不大，而在COI基因片段中T的比例明显高于A的比例。

表3 4种贝类16S r RNA和COI基因片段序列平均碱基含量Tab.3 Average base composition of 16Sr RNA and COI gene fragments of four shellfishes （%）

2.3 4种贝类的遗传多样性分析

由表4可知，就16S rRNA而言，四角蛤蜊单倍型多样性最高（Hd＝0.933），中国蛤蜊最低（Hd＝0.411），日本镜蛤与西施舌相差不大；而西施舌核苷酸多样性最高（Pi＝0.009 37），中国蛤蜊最低（Pi＝0.001 74），四角蛤蜊与日本镜蛤相差不大。COI基因结果显示，四角蛤蜊单倍型多样性最高（Hd＝1.000），中国蛤蜊最低（Hd＝0.874），日本镜蛤与西施舌相差不大；西施舌核苷酸多样性最高（Pi＝0.013 47），中国蛤蜊最低（Pi＝0.003 49）。

表4 基于16S r RNA和COI基因片段的4种贝类遗传多样性分析Tab.4 Analysis of genetic diversity based on 16S r RNA and COI gene fragments

3 讨论

国外已有学者对双壳类mtDNA、16S rRNA及COI基因序列开展研究［20-21］。本研究扩增测定了日本镜蛤、四角蛤蜊、中国蛤蜊和西施舌的16SrRNA及COI基因片段序列，分析了各个物种之间的差异以及同一物种不同标记之间的差异，初步得到了启东海域4种贝类的遗传多样性本底信息，为该地区贝类资源管理、保护和监测工作提供基础数据支撑。

3.1 碱基组成分析

有关无脊椎动物线粒体全基因组测序的报道均显示，其基因序列碱基组成比例为A＋T＞G＋C。且对于16S rRNA基因，rRNA的生物学活性不仅依赖于DNA序列的一级结构，也依赖于二级甚至三级结构。rRNA基因的二级结构由多个大小不一的茎环组成，通过G-C、A-U甚至不太稳定的G-U配对来维持，其二级结构中的环富含A，而茎富含G，由于G-C之间氢键的作用力大于A-U和G-U，因此茎中富含G有利于维持其二级结构［22-23］。

本研究结果亦显示，4种贝类16S rRNA和COI标记的碱基比例都是A＋T＞C＋G，这与无脊椎动物线粒体DNA碱基组成特点相符［3］。从16SrRNA标记看，碱基A与T的比例相差不大，但碱基G的比例大于C，该碱基比例与孟学平等［4］对西施舌、中国蛤蜊和四角蛤蜊的研究结果以及陈淑吟等［10］对西施舌的研究结果大致相似，符合rRNA碱基组成特点。从COI标记看，碱基T的比例大于A，碱基G的比例大于C。该碱基比例与朱立静等［3］对四角蛤蜊的研究结果相似，与陈淑吟等［10］对西施舌的研究结果有一定差异，但总体比例相差不大，而与王帅［14］对西施舌长乐群体的研究结果差异较大，其结果显示，西施舌COI基因A／G／C／T所占的比例分别为42.27%、15.32%、21.41%、21.00%，原因可能是西施舌长乐群体与其他群体遗传分化距离较远。

3.2 遗传多样性分析

遗传多样性不仅是形成生物多样性的基础，也是物种进化潜能的保证，核苷酸多样性（Pi）表示每个群体内各个单倍型的两两配对差异的平均值，是衡量群体遗传多样性的一个重要指标［24］；两个随机群体选取的mtDNA序列间核苷酸多样性值越小，群体的遗传多样性越低。核苷酸多样性指数Pi值考虑了各种mtDNA单倍型在群体中所占的比例，能够精确反映一个群体mtDNA的多态程度［25］。GRANT和BOWEN［26］根据单倍型多样性（Hd）和核苷酸多样性（Pi）两者的关系将种群事件分为4种模式：第一类为Hd和Pi均低（Hd＜0.5，Pi＜0.005）；第二类为Hd高而Pi低；第三类为Hd低而Pi高；第四类为Hd和Pi均高。

本研究中，从16S rRNA基因来看，西施舌、四角蛤蜊和日本镜蛤的单倍型多样性水平较高（Hd＞0.5），核苷酸多样性水平也较高（Pi＞0.005），属于第四类情况，其遗传多样性处于一个较高的水平；而中国蛤蜊的单倍型多样性水平（Hd＜0.5）和核苷酸多样性水平（Pi＜0.005）均较低，属于第一类情况，表明其最近发生了种群瓶颈效应或由单一、少数系群所发生的创立者效应（founder effect）。从COI基因来看，西施舌和四角蛤蜊的单倍型多样性水平较高（Hd＞0.5），并且核苷酸多样性水平也较高（Pi＞0.005），属于第四类情况，其遗传多样性水平较高；而日本镜蛤和中国蛤蜊的单倍型多样性水平较高（Hd＞0.5）而核苷酸多样性水平较低（Pi＜0.5），属于第二类情况，可能是经历了瓶颈效应后，种群的迅速生长和基因突变的积累导致的。

陈淑吟等［10］在2007年对西施舌启东群体的16SrRNA和COI基因标记的遗传多样性进行了调查，其核苷酸多样性指数Pi分别为0.005 49和0.009 22，均比本实验结果低，其中16S rRNA基因标记可能是因为扩增所用的引物序列不同，导致结果有所差异，而COI基因标记提示西施舌启东群体10多年后COI基因片段的变异程度有所提高，这可能由取样位点的差异或取样方法的不同导致，也可能是线粒体基因组遗传变异的结果［12］。朱立静等［3］从COI基因标记的角度对四角蛤蜊的南通群体和连云港群体的遗传多样性进行调查，结果显示，其核苷酸多样性指数分别为0.007 74和0.004 56，本实验结果与其相差不大。王帅［14］从COI基因角度对西施舌山东群体和长乐群体的遗传多样性进行了分析，结果显示，核苷酸多样性指数分别为0.007 315±0.006 113，0.004 661±0.003 247，与本实验相比，山东群体的四角蛤蜊遗传多样性水平更接近启东群体，而长乐群体的遗传多样性水平较低。这可能是因为在地理分布上，启东群体与山东群体的距离较近，而遗传分化距离也较近，而与长乐群体的遗传分化距离较远。

3.3 贝类遗传多样性与生态系统功能之间的关系

生物多样性与生态系统功能的关系是生态学研究的一个热点，了解和掌握生物多样性与生态系统功能的关系及其内在机制对于生物多样性、生态系统保护及其合理利用意义重大。生物多样性包括遗传多样性、物种多样性和生态系统多样性，遗传多样性是生物多样性的重要组成部分，但目前研究多集中于物种多样性与生态系统功能的关系上，有关遗传多样性与生态系统功能之间的关系研究仅局限于植物研究中［27］。

贝类的生态作用通常体现在水体生态中，可降低水体中颗粒有机物（藻类和有机碎屑）的浓度，间接控制氮磷营养盐浓度，耦合水层—底栖环境，保护生物多样性和营造生物生境，因此贝类是一种常用的水体生态修复治理生物，并且承担了生态系统中一部分的固碳作用。贝类的生态修复功能多以贻贝（Mytilus edulis）和牡蛎科贝类为主体［6］，而帘蛤目贝类的生态作用主要为固碳效应，并且可以耦合水层—底栖环境。与森林的固碳作用相比，贝类所固定的碳在自然过程中不易释放，能够在较长的时间产生作用［28］，且据张继红等［7］对贝类固碳作用进行的核算和研究，蛤蜊对生态系统中碳的固定作用是相当明显的。另一方面，贝类将水体中的悬浮物质通过消化道，经重新“包装”后将这些颗粒物以粪便的形式运回水体，从而将水层环境和底栖环境联系起来［8］，粪粒有机质可能是无脊椎动物消费者获得能量的重要来源之一，因此会影响底栖动物的生长与分布。并且在一些大规模的贝类养殖海区，当水交换受到限制时，贝类所排出的粪便聚积于海底，进而导致氧的消耗和大型底栖生物数量的减少［29］。

综上，贝类的遗传多样性不仅反映其自身的资源状况，还会间接影响水域生态系统的结构和功能状况，具有重要的研究意义。本研究通过对江苏省启东地区4种贝类的16S rRNA及COI基因片段序列进行分析，初步掌握其遗传多样性状况，研究结果可为当地的贝类种质资源监测、保护以及海域生态修复提供数据支持。