斑鱾dmrt1的克隆及其表达分析

温思民，翟 毅，黄 洋，2，朱春华，2，4，李广丽，2，3

（1.广东海洋大学水产学院，广东湛江 524088；2.广东省名特优鱼类生殖调控与繁育工程技术研究中心，广东湛江 524088；3.广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室，广东湛江 524088；4.广东省海水养殖生物育种工程实验室，广东湛江 524088）

dmrt （doublesex and mab-3 related transcription factors）基因家族是一类与果蝇（Drosophila melanogaste）性别决定基因 dsx（doublesex）和秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）性别决定基因mab-3（male abnormal-3）同源的基因［1-2］。该基因家族成员的主要特征是所编码的蛋白质包含一个能与DNA序列结合，且高度保守的DM 结构域（doublesex and male aberrant-3 relative domain），这些蛋白质可通过其锌指结构与特定的DNA序列结合，调控下游基因的表达，在性别决定与分化、胚胎发育、组织器官形成等生物学过程起着重要作用［3-4］。作为dmrt基因家族的一员，dmrt1基因编码的蛋白质具有典型的DM结构域，该基因在无脊椎动物和脊椎动物中均存在，是参与性别决定的最古老的基因，具有进化保守性。dmrt1基因广泛存在于哺乳动物、鸟类、爬行类和鱼类中，参与动物性别决定与分化，在雄性性腺的表达水平高于雌性［5］。在人类中，DMRT1基因在男性胚胎的生殖嵴中特异表达，在女性中不表达，该基因在维持睾丸的细胞形态和功能方面发挥重要作用，缺失会导致发生睾丸向卵巢的转分化［6］。在小鼠中，Dmrt1基因在XX和XY早期胚胎的生殖嵴表达，但在性别决定后逐渐转变为只在睾丸中特异表达，敲除Dmrt1基因的XY雄性小鼠会导致睾丸分化受阻，最终丧失生殖细胞［7］，而XX雌性小鼠Dmrt1基因的突变虽然会减少鼠胚卵巢中原始卵泡的形成，但不影响其生育能力［8］。在鱼类中，dmrt1基因最早在尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）和虹鳟（Oncorhynchus mykiss）中得到鉴定，并且仅在这两个物种的精巢中表达，表明该基因是重要的雄性相关基因［9-10］。XY雄性尼罗罗非鱼dmrt1功能缺陷会导致其精巢退化，表现为输精管畸形、精原细胞退化甚至完全丧失生殖细胞［11］。MATSUDA 等［12］和NANDA 等［13］在2002年分别独立在青鳉（Oryzias latipes）中发现了鱼类的第一个雄性性别决定基因，即Y染色体上的DM结构域基因（DM-domain gene on the Y chromosome，dmy），也称Y染色体性别决定区dmrt1的重复拷贝基因dmrt1bY，dmy基因的自然突变会导致XY青鳉发生由雄性向雌性的性逆转，而在XX雌性青鳉中过表达dmy会诱导发生卵巢向精巢的转分化。此外，敲除常染色体dmrt1基因的XY青鳉会发育为雌性并具有正常生育能力，而通过挽救实验过表达的dmrt1，可使其发育为正常雄性［14］。与青鳉类似，敲除dmrt1的XY雄性斑马鱼（Danio rerio）大多数发育为具有生育能力的雌性，少数成为不育的雄性，表现为精巢发育受阻，最终丧失生殖细胞［15］。以上研究表明，dmrt1基因参与脊椎动物性别分化和精巢的功能调控。

斑鱾（Girella punctata），又称瓜子鱲，俗名黑毛鱼，隶属于鲈形目（Perciformes），鲈亚目（Percoidei），鱾科（Girellidae），鱾属，是近海暖水性岩礁鱼类，食性为杂食性，主要以藻类和小型无脊椎动物为食，体长最长可达50 cm。斑鱾属雌雄异体鱼类，雌雄鱼表型基本相同，不易分辨，但雌雄性腺发育不一致，雄鱼需2年性成熟，雌鱼需3年性成熟，该鱼的产卵期在2—6月，栖息于岩礁、石砾底质的近岸水域，主要分布于中国的东海、南海和台湾岛附近海域，以及朝鲜、日本和菲律宾沿海［16-18］。斑鱾肉质洁白鲜嫩、营养丰富，经济价值极高，是名贵高档的经济鱼类，深受消费者青睐，具有十分广阔的市场前景。但目前斑鱾尚不能进行规模化人工繁殖，市场消费的成鱼及海水网箱养殖的斑鱾苗种均主要来自海捕，这在一定程度上制约了斑鱾规模化养殖的发展。dmrt1基因作为鱼类的重要生殖发育调控基因，在斑鱾中尚未见相关研究报道。本研究以斑鱾为研究对象，克隆其dmrt1基因，运用生物信息学技术预测其Dmrt1蛋白的性质与结构，并分析dmrt1基因在斑鱾雌雄性腺和胚胎发育过程中的表达模式，以期为斑鱾生殖发育调控及性别分化研究提供基础资料。

1 材料与方法

1.1 实验动物及样品采集

斑鱾来自珠海育成鱼苗养殖有限公司，体质量230～347 g，体长23.9～28.2 cm，3雌3雄。麻醉后取部分性腺组织液氮速冻后-80℃保存，用于提取总RNA及后续基因克隆；剩余部分性腺组织用Bouin’s液固定，乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋、切片，苏木精-伊红（HE）染色后用于性腺组织学观察。斑鱾胚胎样品取自中国台湾省台南市屏东县东港镇的中国台湾水产试验所东港分所，受精卵在温度为（26.0±0.5）℃、盐度为31的海水中培育。用120目筛绢网捞取受精卵，用体视显微镜（Thermo，XTL-2400，美国）进行胚胎发育观察及图片采集，并取不同发育时期胚胎样品各30颗液氮速冻后-80℃保存，用于总RNA提取。

1.2 总RNA提取和cDNA合成

采用Trizol试剂盒（Invitrogen，15596018，美国）分别提取胚胎和性腺的总RNA。用1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性，并用Nanodrop 2000超微量核酸蛋白测定仪（Thermo Scientific，美国）检测RNA的浓度和质量。RNA质量检测合格后，按照PrimeScriptTMRTreagent Kit with gDNA Eraser（TaKaRa，RR047A，日本）说明书合成cDNA。

1.3 斑鱾dmrt1 ORF的克隆与序列分析

从NCBI数据库中获得黄金鲈（Perca flavescens）和白梭吻鲈（Sander lucioperca）等鲈形目物种dmrt1 cDNA序列，在本实验室斑鱾性腺转录组数据库（BioProject ID：PRJNA752004）中进行生物信息学比对分析，找到斑鱾dmrt1可能转录本（7 204 bp），用Primer Premier 5.0软件根据转录本序列设计特异性引物对该基因ORF进行克隆验证，引物由上海生工生物技术公司合成（表1）。采用2×PCR MIX（P2014，东盛生物科技公司）进行基因扩增。PCR反应程序：94℃预变性5 min；94℃30 s，54℃30 s，72℃1 min，32个循环；72℃延伸10 min。将得到的PCR产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，用DNA凝胶回收试剂盒（N1072，东盛生物科技公司）对目的条带进行切胶回收、连接、亚克隆、挑选阳性克隆送至上海生工生物有限公司测序。

使用NCBI的ORF finder（https：／／www.ncbi.nlm.nih.gov／orffinder／）在线预测斑鱾dmrt1开放阅读框（open reading frame，ORF）；使用在线分析软件ExPASy Proteomics Server（http：／／ca.expasy.org）推导其氨基酸序列、分子量计算值和理论等电点等；使用SignalP 5.0 Server（http：／／www.cbs.dtu.dk／services／SignalP）预测其信号肽序列；使用TMHMM Server 2.0（http：／／www.cbs.dtu.dk／services／TMHMM）预测其跨膜结构域；使用SoftBerry-Psite（http：／／linux1.softberry.com）预测其氨基酸序列中的功能位点分布；使用SMART（http：／／smart.embl-heidelberg.de）分析其蛋白质结构功能域；使用PSORT II Prediction（http：／／psort.hgc.jp／form2.html）预测其亚细胞定位；使用SOPMA（https：／／npsa-prabi.ibcp.fr／cgi-bin／npsa_automat.pl？page＝npsa_sopma.html）预测Dmrt1蛋白的二级结构；运用ExPASy的SWISSMODEL（http：／／www.swissmodel.expasy.org）进行建模分析；采用NCBI在线序列比对（http：／／blast.ncbi.nlm.nih.gov／Blast.cgi）进行序列同源性比对和相似性分析；运用DNAMAN 9进行蛋白序列的多重比对分析；采用MEGA X软件以邻位相连法（neighbor-joining）构建各物种Dmrt1系统进化树［19］。

1.4 实时荧光定量PCR检测

采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术检测dmrt1在雌雄性腺和不同胚胎发育时期的表达。操作步骤参照SYBR®Green Real Time PCR Master Mix试剂盒（TOYOBO，QPK-201，日本）说明书进行。反应体系为：SYBR®Green Real Time PCR Master Mix 10μL，cDNA 2μL，10μmol·L-1上下游引物各0.8μL，再用超纯水补齐至20μL。设置反应程序：95℃预变性5 min；95℃30 s，54℃20 s，72℃20 s，40个循环；72℃延伸5min。以β-actin为内参基因，引物见表1。用2-ΔΔCT方法计算dmrt1在斑鱾雌雄性腺和不同胚胎发育时期中的相对表达量。

表1 PCR相关引物序列Tab.1 Primers used for PCR

1.5 数据处理

用SPSS 25.0对dmrt1在斑鱾雌雄性腺的表达数据进行独立样本t检验分析，对dmrt1在斑鱾不同胚胎发育时期的表达数据进行单因素方差分析和Duncan多重比较分析，数据用平均值±标准误差（mean±SE）表示，n＝3，当P＜0.05时表示组间差异具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 斑鱾dmrt1 ORF的克隆及生物信息学分析

克隆得到的斑鱾dmrt1 ORF全长为894 bp，编码297个氨基酸（图1）。对斑鱾Dmrt1蛋白进行预测分析，结果表明该蛋白原子总数为4 414，分子结构式为C1374H2154N406O457S23，理论分子量为32.41 ku，理论等电点（pI）为7.01；不稳定系数64.19，大于阈值40，性质不稳定；脂溶指数为53.60，总平均亲水性（GRAVY）为-0.638，属亲水性蛋白，位于细胞核，不存在信号肽与跨膜区，含有4个N-糖基化位点、1个蛋白激酶C磷酸化位点、3个酪蛋白激酶II磷酸化位点、6个N-肉豆蔻酰化位点、2个异戊二烯基结合位点和4个微体C末端靶信号位点（图1）。在蛋白N端27～80位具有一个与果蝇Dxs和线虫Mab-3蛋白相似的DM结构域，用SOPMA软件预测Dmrt1蛋白的二级结构，结果显示，无规则卷曲所占的比例最高，占64.65%，延 伸 链 占14.14%，α-螺 旋 占17.51%，蛋白质的二级结构中有超过半数的氨基酸参与形成无规则卷曲结构，说明该蛋白质整体处于一个以无规则卷曲为主的二级结构中。将Dmrt1氨基酸序列提交至SWISS-MODEL软件，自动搜索同源蛋白作模板，得到以人类DMRT1的DM结构域模型（PDB ID：4yj0.1.A）为模板构建的斑鱾Dmrt1的DM 结构域模型（图2），相似性为87.10%，这表明了Dmrt1的DM结构域在进化上的保守性。

图1 斑鱾dmrt1的核苷酸序列及其编码的氨基酸序列Fig.1 Nucleic acid and amino acid sequences of dmrt1 gene in G.punctata

图2 不同鱼类和人类的Dmrt1／DMRT1蛋白的DM 结构域模型Fig.2 DM domain model of Dmrt1／DMRT1 protein in different fishes and Homo sapiens

2.2 斑鱾Dmrt1的同源性及进化分析

将斑鱾Dmrt1蛋白序列与其他物种的蛋白序列进行同源比对分析，斑鱾Dmrt1与黄金鲈的同源性最高，为85.71%，与人类的同源性最低，为32.89%（表2）。多重序列比对分析发现，斑鱾和其他脊椎动物的Dmrt1均含有保守的DM结构域（图3），斑鱾Dmrt1的DM结构域与黄金鲈、白梭吻鲈、橙胸镖鲈（Etheostoma obama）和欧洲海鲈（Dicentrarchus labrax）的同源性为96.30%，与斑马鱼的为90.74%，与人类的为87.10%，DM结构域的高度同源性表明了其在进化上的保守性。

图3 斑鱾与其他物种的Dmrt1的蛋白序列多重比对Fig.3 Comparison pf Dmrt1 protein alignment of in G.punctata and other species

表2 斑鱾Dmrt1与其他物种的同源性Tab.2 Homology between Dmrt1 in G.punctata and other species

在斑鱾和其他脊椎动物的Dmrt1蛋白序列系统进化树中，斑鱾与黄金鲈、白梭吻鲈等鲈形目鱼类聚为一支，与斑马鱼、人类和小鼠等分离，这与传统分类地位一致（图4）。

图4 不同脊椎动物的Dmrt1系统发生分析Fig.4 Phylogenetic analysis of Dmrt1 in vertebrates

2.3 斑鱾雌雄性腺的组织学观察

雌雄性腺组织切片HE染色结果表明，该时期斑鱾精巢均处于III期，精原细胞呈近圆形或椭圆形，细胞中央有一大圆核，核透亮，核仁被苏木精染成深蓝色，胞质被伊红染成淡红色；精母细胞由精原细胞增殖分裂产生，数量较多，染色程度较精原细胞深。斑鱾卵巢均处于II期，卵母细胞的形状不规则，呈近圆形、多边形或梨形等，细胞核偏位，占卵母细胞的比例较大（图5）。

图5 斑鱾雌雄性腺的组织切片观察Fig.5 Histological observation of male and female gonads of G.punctata

2.4 dmrt1在斑鱾成体雌雄性腺的表达

qRT-PCR数据分析显示，dmrt1在II期卵巢有微弱表达，在III期精巢中有较高表达，雄性的表达水平显著高于雌性（P＜0.05）（图6）。

图6 dmrt1在斑鱾雌雄性腺的相对表达Fig.6 Relative expression of dmrt1 in male and female gonads of G.punctata

2.5 斑鱾胚胎发育观察

斑鱾受精卵属端黄卵，为无色透明的圆球形，受精卵直径为（973.92±21.46）μm（n＝36），具有1个油球，油球直径为（221.55±11.68）μm。斑鱾受精卵在温度为（26.0±0.5）℃、盐度为31的海水中培育，从受精到超过50%的仔鱼孵出，整个胚胎发育过程历时24 h 36 min，胚胎发育各个阶段及主要发育特征见表3和图7。

图7 斑鱾胚胎发育Fig.7 Embryonic development of G.punctata

表3 斑鱾胚胎发育时序Tab.3 Embryonic development of G.punctata

2.6 dmrt1在斑鱾胚胎不同发育时期的表达

qRT-PCR数据分析显示，dmrt1表达水平在斑鱾胚胎发育过程中呈先上升后降低的趋势，在桑葚期表达水平最高，囊胚期开始降低，原肠期后表达水平急剧下降，至初孵期几乎不表达（图8）。

图8 dmrt1在斑鱾胚胎不同发育时期的相对表达Fig.8 Relative expression of dmrt1 in embryo at different development stages in G.punctata

3 讨论

本研究克隆的斑鱾dmrt1基因的ORF全长为894 bp，编码297个氨基酸。运用生物信息学方法预测分析斑鱾Dmrt1蛋白的结构与性质，结果显示，该蛋白无N端信号肽和跨膜区结构，位于细胞核，属不稳定性亲水蛋白，预测结果与其结合特定DNA序列调控下游基因表达的特性相符。斑鱾Dmrt1蛋白的蛋白结构、细胞定位、稳定性和疏水性等多项预测结果与奥里亚罗非鱼（Oreochromis aureus）、胡 子 鲇（Clarias fuscus）Dmrt1的预测结果相似［20-21］。通过与其他脊椎动物Dmrt1多重蛋白比对发现，斑鱾Dmrt1存在较为保守的DM结构域序列，这预示着斑鱾Dmrt1具有与其他脊椎动物Dmrt1相似的功能。而斑鱾Dmrt1除DM结构域外的序列与其他脊椎动物的同源性差异较大，表明Dmrt1蛋白在不同进化地位的物种间仍然具有一定差异。

dmrt1基因是dmrt基因家族中研究最广泛的性别调控相关基因，广泛存在于各种鱼类中，但在不同物种间存在时序和组织表达差异。在鱼类dmrt1基因性别相关研究中发现，dmrt1是具有性别二态性的雄性高表达基因，即其在精巢中的表达量要远远高于在卵巢及其他组织中的表达量，有些鱼类的dmrt1基因甚至只在精巢中特异性表达。如斑马鱼［22］性腺切片原位杂交表明，dmrt1在精巢和卵巢发育的生殖细胞中均有表达，且Northern印迹杂交结果显示，其在精巢的表达远高于卵巢；虹鳟［10］Northern印迹杂交结果显示，dmrt1在其整个精子发生过程中持续表达，且通过RT-qPCR技术检测到dmrt1在其卵巢中的微弱表达。银汉鱼（Odontesthes bonariensis）［23］、红 鳍 东 方 鲀（Takifugu rubripes）［24］和 香 鱼（Plecoglossus altivelis）［25］等鱼类dmrt1研究结果与斑马鱼类似。此外，在成体青鳉［26］、尼罗罗非鱼［27］和黑鲷（Acanthopagrus schlegeli）［28］等鱼类中，dmrt1仅在精巢中特异性表达，在其他组织中不表达。而在本实验中，斑鱾dmrt1在雌雄性腺中的表达模式与前者一致，其在雄性III期精巢中有较高表达，在II期卵巢中微弱表达，这预示着其可能不仅与精巢发育有关，还可能在卵巢发育过程中起作用。

胚胎发育阶段，在斜带石斑鱼（Epinephelus coioides）［29］、稀有鮈鲫（Gobiocypris rarus）［30］、黄颡鱼（Pelteobagrus fulvidraco）［31］、香鱼［25］和河川沙塘鳢（Odontobutis potamophila）［32］等鱼类研究中发现，dmrt1基因从受精卵裂到出膜孵化整个胚胎发育过程均有表达，表达水平随着胚胎发育呈现出先升后降的趋势，但不同物种到达最高表达的时期有所差异，如斜带石斑鱼和稀有鮈鲫的dmrt1的表达水平在囊胚期达到最高值，而黄颡鱼、黄河鲤（Cyprinus carpio）［33］、香鱼和河川沙塘鳢在原肠期达到峰值。此外，有些鱼类在胚胎发育阶段 dmrt1 基因不表达，如大口黑鲈（Micropterus salmoides）［34］，在孵化后40 d才开始出现dmrt1的表达。在本研究中，斑鱾dmrt1在胚胎发育的卵裂期到原肠期有较高表达，而原始生殖细胞（PGCs）最早发现于原肠胚时期，推测dmrt1在胚胎发育前期的高表达与原始生殖细胞的形成有关。此外dmrt1在斑鱾初孵仔鱼期几乎不表达，这与已有研究结果不同，有可能是一种新的表达模式，仍有待进一步研究。

综上所述，本研究克隆的斑鱾dmrt1基因的序列，其所编码的蛋白具有典型的Dmrt1结构特征，在进化上与鲈形目鱼类的Dmrt1同源性高。在雌雄性腺和胚胎发育过程中的表达模式表明，斑鱾dmrt1基因可能参与了性腺分化和早期胚胎发育。