长江口邻近海域蓝点马鲛耳石微量元素初步分析

瞿俊跃，方 舟，2，3，4，5，陈新军，2，3，4，5

（1.上海海洋大学海洋科学学院，上海 201306；2.大洋渔业资源可持续开发教育部重点实验室，上海 201306；3.国家远洋渔业工程技术研究中心，上海 201306；4.农业农村部大洋渔业开发重点实验室，上海 201306；5.农业农村部大洋渔业资源环境科学观测实验站，上海 201306）

蓝点马鲛（Scomberomorus niphonius），属鲈形目（Perciformes）鲭科（Scombridae）马鲛属，广泛分布于中国、日本和韩国近海的暖温性水域中［1-3］。该物种为高度洄游经济性鱼种，在近年来气候事件频发且中国近海渔业资源日益衰退的背景下，蓝点马鲛仍然是少数维持高产的鱼类之一，近5年在我国的年产量保持在30～40万t之间［4-6］。掌握鱼类的生活史，有助于进一步了解不同时期鱼类的生境变化情况，进而为渔业资源可持续利用和管理提供参考依据［7］。耳石作为探究鱼类生活史过程的优良材料之一，具有不易被破坏的外形结构，同时含有丰富的生态信息，目前已被广泛用于群体划分［8-10］、年龄与生长［11-14］、生境反演［15-16］等方面的研究。同时耳石主要由碳酸钙组成，具有代谢惰性，鱼类生活环境中的相关元素会永久沉积于耳石中［17-18］。鱼类耳石能吸收其所栖息的环境元素，元素一旦被沉积就很难再被机体吸收，成为记录鱼类生活史足迹的元素指纹。因此，耳石的微化学分析可以重建鱼类的生活史历程或者揭示其特定生活史阶段所经历的水环境变化［19-23］。目前，利用该方法已经成功地推测了我国近海小黄鱼（Larimichthys polyactis）［24］、棘 头 梅 童 鱼（Collichthys lucidus）［25］、鮸（Miichthys miiuy）［26］等石首鱼科鱼类在不同时期的生境变化规律。作为典型的长距离洄游性种类，蓝点马鲛有着显著的沿岸—外海洄游的特征［2］。已有相关的研究对黄海蓝点马鲛耳石微化学进行了初步分析，对其生活史情况有了初步了解［15］，然而目前仍集中于关于耳石中微量元素组成，并仅简单分析不同时期微量元素的变化情况。蓝点马鲛不同生活史时期所处的栖息环境和特征有较大的不同［15-16］，研究主要生活史的变化规律有着重要意义。为此，本研究选取拖网船在长江口邻近海域所捕获的蓝点马鲛个体，分析其耳石的微量元素组成，讨论不同耳石区域微量元素的变化，结合回归树分析，初步划分蓝点马鲛的生活史阶段，推测其不同生长阶段的生境变化，以期为后续合理开发、利用以及养护该重要渔业资源提供参考依据。

1 材料和方法

1.1 样本来源

本研究所用样本是由底拖网渔船在长江口邻近海域采集，捕捞作业海域见图1。所用的网具为有翼单囊拖网，网具主尺度55 m×26 m，上纲长37 m、下纲长42 m、网目尺寸25 mm。样本采集以非禁渔期时期每个月采一次，每次保证样品数量在20尾左右，时间跨度为2018年9月—2019年2月。

图1 长江口邻近海域蓝点马鲛采样站点Fig.1 Sampling locations of Scomberomorus niphonius in waters adjacent to the Yangtze Estuary

1.2 生物学测定与耳石提取

在实验室解冻后对蓝点马鲛进行生物学测定，包括叉长（fork length，FL）、体质量（body weight，BW）和性别，叉长精确至1 mm，体质量精确至1 g。利用镊子提取出蓝点马鲛的一对矢耳石，并存放于盛有95%乙醇溶液的带有编号的离心管中保存。

1.3 耳石研磨与微量元素测定

对蓝点马鲛耳石采取横截面研磨，耳石切片的制作过程包括包埋、切割、研磨和抛光。先将耳石清洗干燥后放入塑料模具中，沿壁缓慢倒入由固化剂与亚克力粉调配而成的包埋剂来进行耳石包埋，并放置到通风阴凉处待其完全硬化；然后用120、600、1 200和2 500目的防水耐磨砂纸将耳石逐步研磨至核心，研磨过程中需不断在显微镜下观察，以免磨过核心；最后用氧化铝水绒布抛光研磨好的切片，再将研磨好的耳石切片进行编号保存。

本研究共计选取了研磨后的18枚耳石切片（表1），使用激光剥蚀电感耦合等离子体质谱仪（laser ablation inductively coupled plasma mass spectrometry，LA-ICP-MS）来进行耳石打点与微量元素测定。耳石打点采用等距法的方式进行，从核心区至边缘区每100μm取一个样点，每个耳石长轴平均能获得7～9个样点。微区每个取样点测定所含的元素，激光剥蚀过程中采用氦气作载气、氩气为补偿气以调节灵敏度。每个时间分辨分析数据包括大约20 s的空白信号和60 s的样品信号。具体仪器的操作条件见表2。采用ICPMSDataCal软件对数据进行离线处理（包括对样品和空白信号的选择、仪器灵敏度漂移校正、元素含量计算）。

表1 长江口邻近海域蓝点马鲛信息Tab.1 Information of Scomberomorus niphonius in waters adjacent to the Yangtze Estuary

表2 耳石LA-ICP-MS工作参数Tab.2 Analytical parameters of LA-ICP-MS for otolith

1.4 数据分析

1）基于ICPMSDataCal软件处理完的数据，选择出均值大于0.1 mol·mol-1的元素，并依据各元素浓度含量利用随机森林法（random forest）进行分析，选取相对重要性超过5%的元素。随机森林是通过自助法（bootstrap）重采样技术，从原始训练样本集N中重复随机抽取k个样本生成新的训练样本集合，然后根据自助样本集生成k个分类树组成随机森林，新数据的分类结果按分类树投票多少形成的分数而定。其实质是对决策树算法的一种改进，将多个决策树合并在一起，每棵树的建立依赖于一个独立抽取的样品，森林中的每棵树具有相同的分布，分类误差取决于每一棵树的分类能力和它们之间的相关性。然后将上述重要元素通过与Ca的比值进行呈现，并且分别求出它们的最大值、最小值、平均值和标准差。

2）为消除各元素绝对值的误差，绘制各微量元素与Ca比值在时间序列上的分布模式图，根据所打点的位置比较不同生长阶段上微量元素沉积的差异。

3）基于相关重要性较高的微量元素（大于10%），采用多元回归树模型（multivariate regression tree model，MRT）来形成多个时间序列聚类，进而划分出蓝点马鲛不同的生活史阶段，再结合微量元素比值在时间序列上的变化趋势来大致推测出蓝点马鲛的栖息地分布及其变动。

本文所有统计方法均通过R语言（3.63版本）操作完成，其中模型运用的加载包为randomForest和mvpart［27-28］。

2 结果与分析

2.1 耳石主要微量元素分析

蓝点马鲛耳石中共检测出元素14种（浓度大于0.1μmol·mol-1），其中浓度最高的为Ca元素，浓度为（410 858.54±665.55）μmol·mol-1（表3）。耳石各微量元素含量从高到低依次为钙（Ca）、钠（Na）、锶（Sr）、铁（Fe）、镁（Mg）、锰（Mn）、钡（Ba）、锌（Zn）、镍（Ni）、锂（Li）、镉（Cd）、铜（Cu）、钴（Co）、铅（Pb）。

表3 蓝点马鲛耳石微量元素含量Tab.3 Trace element concentration in Scomberomorus niphonius otolith （μmol·mol-1）

2.2 元素重要性分析

基于随机森林法对蓝点马鲛耳石中14种元素含量进行分析，选取重要性较高的微量元素（图2）。结果表明，Mg、Na、Ca、Mn、Cu、Sr和Ba的重要性较高且可应用于分析生活史变动的研究中（其相对重要性均大于5%）。其中，Mg的重要性相关度最高，说明Mg的含量变化可以较好地呈现蓝点马鲛生活史变动特征，Na和Mn次之，说明这些元素对蓝点马鲛生活史影响较大；而Co、Cd、Zn、Ni、Pb、Fe和Li的相对重要性小于5%，说明这些元素对蓝点马鲛生活史的影响较小，因而不用于之后的聚类分析。

图2 耳石微量元素相对重要性分析Fig.2 Relative importance analysis of trace elements in otoliths

2.3 蓝点马鲛耳石各微量元素比值

对随机森林筛选出的7种重要微量元素Mg、Na、Ca、Mn、Cu、Sr和Ba的含量进行分析，结果见表4。计算与Ca比值后发现，Sr和Na的含量较高，其次为Mg、Mn和Ba，Cu的含量最低（表4）。

表4 蓝点马鲛耳石微量元素与钙的比值Tab.4 Ratio of trace elements to Ca in Scomberomorus niphonius otolith

2.4 蓝点马鲛耳石不同区域元素的组成与差异

蓝点马鲛耳石不同区域上微量元素变动可反映其不同的生长阶段上的特征。各微量元素与Ca的比值在时间序列上有着明显的变化趋势，且均呈现非均匀分布（图3）。耳石Na∶Ca从核心区至450μm处基本不变，在450～600μm过程中逐渐上升，至600μm之后开始呈现快速下降的趋势，于1 350μm处达到最低值；耳石Mg∶Ca从核心区至450μm呈现快速下降的趋势，450μm～1 350μm下降速度减缓，1 350μm过后存在小幅度上升的趋势；耳石Mn∶Ca从核心区开始至600μm呈现小幅上升趋势，至600μm处之后出现明显的下降趋势；耳石Cu∶Ca从核心区至450μm呈现小幅上升的趋势，450～1 350μm呈现阶梯下降的趋势，1 350μm之后存在小幅回升的趋势；耳石Sr∶Ca从核心区至150μm处呈现显著降低，至150～600μm处基本保持不变，600μm之后呈现波动变化；耳石Ba∶Ca从核心区至150μm呈现上升的趋势，150～450μm处呈现下降趋势，450～750μm呈现小幅度回升，750～1 200μm呈现明显的快速下降趋势，1 200 μm之后小幅提升。

图3 耳石微量元素与Ca比值在时间序列上的变化趋势Fig.3 Change trend of the ratio of otolith trace elements to Ca in time series

2.5 多元时间序列上的聚类

根据上述分析，选择相关重要性高的元素（＞10%），采用多元回归模型来对蓝点马鲛耳石的微量元素（即对应不同的生长阶段）进行聚类分析。结果显示，从耳石核心至边缘一共存在4个分割点，分别为150μm、450μm、750μm和1 200μm，与此同时形成了5个聚类，每个聚类里也存在不同数量的节点（图4），其中重要元素比值在不同聚类中存在一定的差异和可参考的生物学特征指标（图5，表5）。聚类1可代表蓝点马鲛生长的早期阶段，Na∶Ca值和Mg∶Ca值从核心至150μm含量存在小幅下降，而Mn∶Ca值存在小幅上升；聚类2中除了Mg∶Ca外其他的微量元素比值的变化趋势不大，Mg∶Ca存在大幅的下降；聚类3中微量元素比值的变化趋势相较聚类2略微有所差异，Na∶Ca值呈现小幅增长，Mg∶Ca值呈现小幅下降趋势，Mn∶Ca值呈现大幅下降；聚类4的生长阶段持续时间较长，其中3个重要元素的比值变化趋势基本一致，呈现出缓慢下降的趋势；聚类5中3个重要元素比值变化趋势各不相同，Mg∶Ca值略有上升，Mn∶Ca值不断下降，降至最低，Na∶Ca值在降到最低后略有上升。

图4 蓝点马鲛耳石微量元素在时间序列上的聚类Fig.4 Cluster of Scomberomorus niphonius otolith trace elements in time series

图5 蓝点马鲛耳石重要微量元素在对应的不同生活史阶段上的变动Fig.5 Change of important otolith trace elements of Scomberomorus niphonius at different life history stages

表5 每个聚类对应的重要元素的含量Tab.5 Concentration of important trace elements corresponding to each cluster

3 讨论

3.1 主要微量元素变化规律

本研究对14个相对稳定的微量元素进行了重要性分析，筛选出了7个重要微量元素，分别为Mg、Na、Ca、Mn、Cu、Sr和Ba。其中Ca元素含量最高。鱼类耳石中含有30多种元素，其中的C、Ca、O构成耳石的基质碳酸钙（CaCO3），其余大多为微量和痕量元素［24］。耳石中元素主要来源于鱼类生活的水环境和食物，同时受发育阶段和生理因素等多方面影响［26］，是一个复杂的生物地化过程（biogeochemical process）。水体元素被吸收进入耳石的过程中，当流经水环境-血液、血液-血液结合蛋白、血液-淋巴液、淋巴液-耳石等4个界面时［29-30］，元素间亲和力和化学行为对耳石中的元素含量起着决定性作用。Sr元素相对含量较高可能是由于Sr是Ca的同族元素，离子半径与Ca接近，软酸离子易进入耳石晶格中，在碳酸钙的沉积过程中Sr离子置换Ca离子进入耳石晶格［31］。Cu元素相对重要是由于软酸离子与血浆蛋白结合会形成稳定的有机化合物，其中70%～100% 的Cu结合在蛋白质结构上［32］，尽管这些蛋白结合物容易排出体外，但由于其较高的含量和稳定性，一定程度上能促使软酸离子进入耳石的晶体结构［32-33］。本研究中重要微量元素与PAN等［15］对黄海海域蓝点马鲛微量元素的研究有所不同。重要微量元素存在差异与东海和黄海的海洋环境存在关联，长江冲淡水带来了大量的陆源污染，因而可能是导致重金属元素Mn和Cu含量偏高的潜在原因［34］。

3.2 不同生长阶段耳石微量元素与生活史特征

蓝点马鲛具洄游性，会在产卵场、索饵场和越冬场之间做长距离的季节性洄游。耳石中微量元素对生境“履历”、洄游模式等研究具有针对性和客观性，即使仅有少量标本依旧可以反演鱼类自然栖息生境的动态变化过程［35-37］。本研究对不同生长阶段耳石微量元素进行了分析。在大多数洄游鱼类耳石中Sr∶Ca值可以反映其生活史处于淡水、半咸水和海水时期的生长环境［38］，从而较为准确而直观地“回溯”生活史“履历”，“重建”其自然栖息环境，且Sr元素表征海域及个体栖息环境的盐度和温度变化，也是个体新陈代谢的重要营养元素［39-40］，但在长江口邻近海域蓝点马鲛耳石微量元素中，Sr∶Ca相对没有规律且含量显著低于同海域的小黄鱼、棘头梅童鱼、鮸和银鲳（Pampus argentus）［24-26］，这可能是由环境温度或者某些特殊生理作用影响所导致，因而蓝点马鲛耳石Sr∶Ca不适合作为其生境履历的指标。

本研究表明，Mg∶Ca、Na∶Ca和Mn∶Ca元素含量在不同生活史阶段存在一定的区别，可以作为生境履历的指标，并基于这3种微量元素对蓝点马鲛生活史进行了回归树聚类，结果表明，蓝点马鲛可能存在5个生活史阶段。已有研究表明，温度对耳石Mg元素值具有一定的影响，因而Mg在各生活史阶段间存在显著性差异，可以代表栖息环境的变动，孵化期耳石中的Mg∶Ca显著高于其他阶段，可能是由于Mg含量与耳石原基碳酸钙晶体存在形式有关［41］，且蓝点马鲛产卵场大多聚集在中国沿岸海域，产卵月份为4—6月，海表温度相对较高，但9月—次年2月蓝点马鲛开始索饵洄游和越冬洄游，向离岸的深层海域洄游，栖息环境海温较低；在产卵阶段，Mg∶Ca比值有一个小幅度的回升，可能是由于3—5月蓝点马鲛开始产卵洄游，重新向海温偏高的近岸浅层水洄游导致的。而Mn元素指示着陆源污染物的含量以及对个体生长发育的影响，生长阶段初期，东海的长江口是蓝点马鲛重要的产卵场之一，Mn∶Ca较高可能与长江口陆源污染较高存在关联［42］。

综上所述，Mg∶Ca、Na∶Ca和Mn∶Ca比值存在差异，这与自身生理机制的调控和生活史不同阶段海域的水环境变化有关，并且Mg∶Ca、Na∶Ca和Mn∶Ca可作为构建蓝点马鲛生境履历的潜在标志。今后的研究中，应该更多考虑将不同时期的环境因子与微量元素相结合，从海洋环境变化的角度更准确地判断蓝点马鲛的生活史变化。