基于UHPLC-Q-Exactive/MS及多元统计分析识别栀子果实不同部位差异化学成分

李忆红，梁雨璐，张洁，解嘉琪，刘传鑫，黄建梅*（1.北京中医药大学 中药学院，北京 102488；2.河南科技大学临床医学院，河南科技大学第一附属医院内分泌代谢中心 内分泌代谢科，河南省遗传罕见病医学重点实验室，国家代谢性疾病临床医学研究中心洛阳分中心，河南 洛阳 471003；3.北京中医药大学 中药品质评价北京市重点实验室，北京 102488）

栀子为茜草科植物栀子（Gardenia jasminoidesEllis）的干燥成熟果实，其味苦，性寒，归心、肺、三焦经；具有泻火除烦，清热利湿，凉血解毒的功效[1]。在我国栀子主产区有江西、浙江、福建、湖南等地[2]，应用广泛，属于原卫生部颁布的第一批药食同源的中药材。栀子作为传统的大宗药材，具有广泛的药理活性，如保肝利胆、抗炎镇痛、抗肿瘤、抗抑郁、降血糖、神经保护等，另外还有改善血液循环、抗血栓、防治脑出血等保护心血管系统的药理活性[3-12]。

在信噪比等于0 dB时，利用多载波系统仿真出的信道冲激响应如图2所示。红色曲线为理想值，蓝色曲线为估计值。可以看出，在信噪比较低的情况下，经过降噪算法处理后的信道冲激响应能够较好的模拟理想值。

生栀子苦寒，炮制可降低栀子的寒性，《中国药典》[1]中有生栀子、炒栀子（清炒至黄褐色）、焦栀子（清炒至焦褐色或焦黑色）3种，是对全果进行炮制，另外在《上海炮制规范》《湖南炮制规范》的记载中，炮制栀子无去壳、带壳的说法，但根据东汉至明清典籍记载，栀子果实的皮仁分用较为常见，目前部分地区中医用药仍沿用古时用法，如清《本草备要》记载“内热用仁，表热用皮”；《本草纲目》记载，栀子用以“治上焦、中焦连壳用，下焦去壳”[13-14]；根据记载，樟帮法[15]炮制栀子是去皮留仁，建昌帮法[16]炮制栀子是以皮、仁分用。栀子果皮、果仁易分离，其皮、仁分用可能是临床使用中两者表现出了药效差异，而这种差异可能来源于栀子果皮、果仁的物质基础的不同。

有研究表明栀子苷、西红花苷Ⅰ、西红花苷Ⅱ在栀子仁中含量比栀子皮中含量高[17]，去乙酰车叶草酸甲酯、京尼平龙胆二糖苷、栀子苷等化合物的含量分布存在差异[18-20]。虽已有文献报道关于栀子果皮、果仁成分差异研究，但选用的指标成分较少，也缺乏系统性。基于此，本试验利用UHPLCQ-Exactive/MS技术对栀子果实不同部位的化学成分进行系统性的快速识别，并结合正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）判别模式对栀子果实不同部位特征性差异化合物进行筛选识别，为栀子果皮、果仁药效差异提供理论依据，也为栀子皮、仁的快速鉴定与临床合理应用提供了基础。

1 仪器与材料

超高效液相色谱与质谱联用仪（Thermo Scientific Q Exactive LC-MS，美国Thermo Fisher公司）；ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）（美国Waters公司）；JA2003B电子天平（上海越平科学仪器有限公司）；KQ-300DB数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；SHZ-D（Ⅲ）循环水式多用真空泵（河南省予华仪器有限公司）；TGL-16aR高速冷冻离心机（上海安亭科学仪器厂）；MX-S涡旋混匀仪（北京博雅创新科技发展有限公司）。

质谱级乙腈、乙酸[赛默飞世尔科技（中国）有限公司]；屈臣氏蒸馏水（广州屈臣氏食品饮料有限公司）；栀子药材采摘于福建，经北京中医药大学杨瑶珺教授鉴定为茜草科植物栀子（Gardenia jasminoidesEllis）的干燥成熟果实。

采用ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）色谱柱；以0.2%乙酸水（A）-乙腈（B）作为流动相，线性洗脱梯度（0～1 min，10%B；1～4 min，10%～15%B；4～18 min，15%～30%B；18～24 min，30%～50%B；24～28 min，50%～100%B；28～31 min，100%B；31～32 min，100%～10%B；32～35 min，10%B）；柱温为30℃；流速为0.3 mL·min-1；进样量为2 μL。

2 方法

2.1 供试品溶液的制备

通过保留时间、质谱裂解规律、文献信息共鉴定了22个差异具有统计学意义的化合物[21-25，27-34，42]，如表2所示，化合物1～7、11、12、14～19、21、22等17种化合物在栀子果皮中的含量更高；而化合物8[鸡矢藤次苷甲酯（scandoside methyl ester）]、9[栀子苷（geniposide）]、10[京尼平龙胆二糖苷（genipin 1-gentiobioside）]、13（Jasminodiol）、20[顺/反西红花苷Ⅰ（trans-crocin Ⅰ/cis-crocin Ⅰ）]在栀子果仁中的含量更高。

2.2 色谱条件

1）首先根据王家会站1992—2016年最大流量，计算频率并绘制频率曲线，取频率p为10%所对应的流量10.0 m3/s为高水流量。

苏东坡在《水调歌头》中有“不应有恨，何事长向别时圆”的句子。苏轼责怪月亮：你为什么偏偏要在我和家人离别的时候又大又圆呢？月亮时圆时缺是自然现象，亘古不变，这种责备实在奇怪，毫无道理，但是，离别过的人却对此句深有感触，它正表达出了词人怀念弟弟之情深，是为“无理有情”，是为“反常合道”。

将Thermo仪器产生的“.raw”格式的数据，通过Abf（Analysis Base File）Converter、MSFileReader软件转换成“.abf”格式的数据，然后利用MSDIAL 4.48软件进行参数设置（误差范围、保留时间范围、加合物类型等），进行峰提取、对齐操作，然后将归一化之后的数据集导出，利用软件SIMCA 14.1进行多元统计分析、主成分分析（PCA）和OPLS-DA。再利用IBM SPSS Statistics 20.0软件对栀子果皮、果仁两组间的数据进行正态性检验（Kolmogorov-Smirnov）和基于均值的方差齐性检验（α＝0.05），然后根据正态性检验和方差齐性检验的结果进行独立样本t检验（正态检验P＞0.05）或独立样本Mann-Whitney U检验（正态检验P＜0.05），筛选出差异具有统计学意义的化合物。

2.3 质谱条件

采用电喷雾离子源（ESI），在负离子模式下（ESI-）对栀子果实不同部位的样品进行分析，扫描范围设定为m/z100～1500 Da。具体的质谱条件参数：毛细管电压3200 V；毛细管温度为350℃，离子源温度为350℃；采用高纯N2作为鞘气和辅助气，鞘气流速为35 L·h-1，辅助气流速为15 L·h-1；采用Thermo Xcalibur 3.0工作站处理数据。

2.4 数据转换与分析

2.艺术范畴的毛笔书法作品。关于毛笔书法作品与艺术之间的关系是不用赘言的。古今名人字画皆是书画爱好者的赏析和收藏的宠儿，也是研究和发展东方艺术的不竭源泉。所谓艺术，即是人类在漫长的生产活动和社会活动中形成和创造的成果，是人们为了满足自身的需求，以一定的物质载体为中介，以丰富的情感来表现社会生活和审美情趣的审美形态。美术作品即是艺术的一种表现形式。而美术作品，是指绘画、书法、雕塑等以线条、色彩或者其他方式构成的平面或者立体的造型艺术作品。毛笔书法作为书法门类中一种独特的表现形式，当然属于美术作品。因此，从艺术范畴的角度来看，毛笔书法作品应该受到著作权法的保护是毋庸置疑的。

3 结果

3.1 UHPLC-Q-Exactive/MS分析

4.1.4 有机酸类 绿原酸易先脱去咖啡酰残基，产生碎片离子m/z191.06[M-caffeoyl-H]-及咖啡酸特征离子m/z179.03 [M-quinate-H]-，然后脱去一分子H2O产生m/z173.04 [M-caffeoyl-H2O-H]-，同时咖啡酰基碎片m/z179.03脱去一分子CO2得到m/z135.04 [caffeoyl-H-CO2]-碎片离子。化合物5、7、19的保留时间分别为1.32、1.93、9.14 min，准分子离子峰均为m/z353.09 [M-H]-，三者的质谱碎片离子数据相同（m/z191.06、179.03、173.04、135.04），说明这3个化合物互为同分异构体，同分异构体化合物无法通过质谱分辨，只能结合文献数据、保留时间和离子丰度差异区分，根据文献报道新绿原酸裂解碎片强度：m/z191＞179＞135；绿原酸裂解碎片强度：m/z191最强，m/z179和m/z135强度相当，较弱；隐绿原酸裂解碎片强度：m/z179＞191＞135[41-45]。化合物7的碎片离子m/z191.06响应最强，m/z179.03、135.04强度较弱，与文献报道的绿原酸裂解规律相符，推测化合物5为新绿原酸（5-O-caffeoylquinic acid），化合物7为绿原酸（3-O-caffeoylquinic acid），化合物19为隐绿原酸（4-O-caffeoylquinic acid）。异绿原酸A、B、C的结构比绿原酸多一分子的咖啡酰基，具有相似的结构碎片。在负离子模式下检测到化合物15、17、18准分子离子峰均为m/z515.12 [M-H]-，二级质谱均有脱去一分子咖啡酰残基的碎片离子m/z353.09 [M-caffeoyl-H]-，通过查阅保留时间及对比文献，推测化合物15为异绿原酸B（3，4-di-O-caffeoylquinic acid），化合物17为异绿原酸A（3，5-di-O-caffeoylquinic acid），化合物18为异绿原酸C（4，5-di-O-caffeoylquinic acid），化合物18异绿原酸C的裂解途径如图6所示。

图1 ESI-模式下栀子果皮（A）、果仁（B）的基峰色谱图Fig 1 Base peak ion current of pericarp（A）and seeds（B）of Gardeniae fructus in negative ion mode

3.2 多元统计分析

采集福建同一批次的20颗栀子果皮、果仁的样本信息，采用多元统计分析寻找差异成分。通过PCA剔除异常值后，利用OPLS-DA筛选栀子果皮、果仁组间贡献率高的变量。如图2中A1、B1所示，在PCA模型中可以观察到一个异常值（P-13、R-9）。在剔除异常值的基础上，建立了OPLS-DA模型。R2（cum）和Q2（cum）分别表示模型的真实性和预测能力。当R2和Q2都小于1，且两个参数接近1时，所建立的模型是稳定合理的。在剔除异常值之后图2 中A2、B2及表1统计分析的参数可以看出，本试验建立的OPLS-DA模型R2和Q2值都小于1，保证了分析结果的准确性，具体ESI-模式下交叉比较的多元统计分析模型相关参数见表1。为了进一步验证所建模型的稳定性，采用置换试验对所建模型进行验证。假设检验在n＝200时进行，结果如图2C所示。R2和Q2的左点均小于最右点，Q2截距为-0.469。该模型具有较好的可预测性，且无过拟合现象。

表1 栀子果皮、果仁比较的多元统计分析模型相关参数(ESI-) Tab 1 Parameters of multivariate analysis model of pericarp and seeds of Gardeniae fructus (ESI-)

3.3 栀子果皮、果仁差异化合物的识别

4.1.1 环烯醚萜类化合物质谱解析 栀子中含有多种环烯醚萜类成分，这些成分在ESI-模式下，一般检测到脱氢准分子离子峰[M-H]-，当流动相中含有酸时，环烯醚萜苷还会生成[M＋HCOO]-[35-37]，如化合物1山栀苷的一级质谱图中可见m/z437.13 [M＋HCOO]-，化合物3栀子新苷可见m/z419.10 [M＋HCOO]-，化合物8鸡矢藤次苷甲酯可见m/z449.08 [M＋HCOO]-。

图2 多元统计分析结果Fig 2 Results of multivariate statistical analysis

取20颗栀子干燥果实（福建同一批次），分离栀子果皮、果仁，分别粉碎，取各粉末（过一号筛）约0.5 g，精确称定，置于50 mL离心管中，精密加入25 mL去离子水，40℃超声提取1.5 h（300 W，40 kHz），减压抽滤，将续滤液以9820 g离心10 min，取400 μL上清液，即得。

表2 栀子果实不同部位差异化合物的鉴定结果 Tab 2 Identification of compounds with statistical difference in different parts of Gardeniae fructus

4 讨论

4.1 化学成分质谱裂解分析

将采集到的两组原始数据导入SIMCA 14.1进行OPLS-DA分析，结果两组数据出现明显差异。如图2中B2所示，栀子果实果皮、果仁样品显著分成两群，结果提示栀子果实不同部位中含有的化学成分存在显著差异。

在串联质谱（MS/MS）中，化合物1山栀苷以m/z391.12458 [M-H]-作为准分子离子峰，对其进行MS2分析，碎片离子m/z229.07、211.06是由准分子离子m/z391.12 [M-H]-依次脱去一分子葡萄糖残基和脱去一分子H2O形成，从而推断出其裂解途径[28，38]，如图3A所示。化合物4去乙酰车叶草苷酸主要脱去H2O、CO2、葡萄糖残基或葡萄糖。碎片离子m/z345.12、209.04是由准分子离子m/z389 [M-H]-分别脱去一分子CO2和葡萄糖残基形成；碎片离子m/z209.04失去一分子CO2，形成碎片离子m/z165.05；碎片离子m/z165.05、147.04也有可能由其前体离子（m/z183.07、165.05）失去一分子H2O形成，由此推测出化合物4去乙酰车叶草苷酸可能的裂解途径[22]如图3B所示。化合物9栀子苷准分子离子m/z387.16 [M-H]-，二级扫描中负离子模式可见失去葡萄糖残基的碎片m/z225.08，说明环烯醚萜类化合物的裂解方式是以糖苷键断裂为主，丢失一分子葡萄糖基和H2O，苷元再次通过逆狄尔斯-阿德尔反应（RDA）方式裂解，生成碎片离子m/z123.04，符合栀子苷的裂解规律[30，40]，如图3C所示。

图3 环烯醚萜类化合物的质谱裂解途径Fig 3 Mass spectra and possible fragment pathways of iridoids

4.1.2 单萜苷类化合物质谱解析 化合物12 jasminoside B、化合物13 jasminodiol是栀子单萜苷类成分，化合物12 Jasminoside B的碎片离子m/z183.10、301.27，是由准分子离子m/z345.15 [M-H]-分别脱去一分子葡萄糖残基和CO2形成；化合物13 Jasminodiol的准分子离子m/z183.10 [M-H]-脱去一分子CO2产生碎片m/z139.11 [M-H-CO2]-。化合物12的碎片离子m/z183.10 [M-H-C6H10O5]-进一步产生碎片离子m/z165.09 [M-H-C6H10O5-H2O]-、121.10 [M-H-C6H10O5-H2OCO2]-[27]，裂解途径如图4所示。

图4 单萜苷类化合物jasminoside B的质谱裂解途径Fig 4 Mass spectra and possible fragment pathways of monoterpenoids jasminoside B

4.1.3 二萜类化合物质谱解析 栀子中二萜类化合物主要为色素类成分，其中包括西红花苷（藏红花素）及其衍生物，查阅文献可以发现藏红花素类成分有很明显的裂解特征，主要是糖苷键的断裂及脱去CO2分子[21，30，41]，化合物20西红花苷Ⅰ分子离子峰m/z975.37 [M-H]-首先脱去两端糖残基得到碎片离子m/z651.26 [M-gen-H]-、327.16 [M-2gen-H]-，碎片离子进一步脱去CO2分别产生碎片离子m/z283.17 [M-2gen-CO2-H]-、239.18 [M-2gen-2CO2-H]-，化合物21的一级质谱的分子离子峰m/z813.32 [M-H]-与化合物20正好相差一个葡萄糖残基的相对分子质量（162 Da），推测其为trans-crocin Ⅱ/cis-crocin Ⅱ，即西红花苷Ⅱ；化合物22的分子离子峰m/z651.27 [M-H]-与化合物20西红花苷Ⅰ相差一个龙胆二糖残基的相对分子质量（324 Da），推测其为trans-crocin Ⅲ/cis-crocin Ⅲ，即西红花苷Ⅲ。化合物20的裂解途径如图5所示。

图5 二萜类化合物西红花苷Ⅰ的质谱裂解途径Fig 5 Mass spectra and possible fragment pathways of crocin Ⅰ

取栀子样品，按“2.2”和“2.3”项下液质条件进行数据采集与分析，栀子不同部位样品在负离子模式下的基峰离子流色谱图（BPI）如图1所示。

结合实际所能得到数据情况，以市州作为决策单元研究某一年的发展情况。选取化肥施用量(X1)、农牧渔业从业人员(X2)、农业机械总动力(X3)、有效灌溉面积(X4)、农业机械总动力(X5)、农业用电量(X6)为投入指标，同时以农牧渔业增加值(Y1)、农民人均纯收入(Y2)、粮食产量(Y3)为产出指标来评价市州的农业循环经济发展情况。

图6 有机酸类化合物异绿原酸C的质谱裂解途径Fig 6 Mass spectra and possible fragment pathways of organic acids 4，5-di-O-caffeoylquinic acid

4.2 提取溶剂的选择

在预试验中，分别以70%甲醇、水两种体系作为提取溶剂，按照“2.2”和“2.3”项下液质条件进行考察，结果表明栀子果皮、果仁的醇提物、水提取色谱图大体相同，其中醇提物的质谱响应稍强，考虑到栀子入药的使用方法及绿色环保的角度，故选择水作为提取溶剂。

蒋大伟吹着口哨，驱车行驶在街道上。姑娘叫郑馨，她的眼睛盯着窗外，额前的头发被风吹得乱飞。蒋大伟从后视镜里看看郑馨，没话找话地：喂，美女，去兰江大桥做啥？郑馨瞥了他一眼，继续看着窗外。蒋大伟猜测地：是来旅游吧？郑馨伸手整理了一下头发，还是一言未发。蒋大伟热情不减地：兰江大桥是咱这地界的标志性建筑！旅游不去兰江大桥等于没来。蒋大伟瞥了一眼后视镜，郑馨瞪大眼睛在看着他，继续说道：你坐我的车就对了！我保证不出一个钟头给你送到大桥顶上！郑馨从耳朵上取下耳机，皱紧眉头：你说什么？蒋大伟泄气地：得，白说了。

4.3 栀子不同部位差异化合物的临床意义

本研究在ESI-模式下筛选鉴定了22个差异成分，其中鸡矢藤次苷甲酯、京尼平龙胆二糖苷、栀子苷、jasminodiol、西红花苷Ⅰ在栀子果仁中的含量更高。研究表明栀子苷、西红花苷都具有抗炎、保肝利胆等作用，并且对神经系统和心脑血管疾病也有治疗作用[3-4，46]，鉴于本试验发现栀子苷及西红花苷Ⅰ在栀子果皮、果仁中分布存在显著差异，果仁中栀子苷及西红花苷Ⅰ分别是果皮中的1.27、1.28倍，可以认为栀子果仁在栀子苷和西红花苷Ⅰ方面的药效比栀子果皮的效果更好；绿原酸及其异构体是一类具有抗氧化、抗菌、降血脂、降血压、降血糖、抗抑郁和焦虑等多方面药理作用的天然化合物[47]，虽然栀子质控的药效成分栀子苷在果仁中分布高于果皮，但绿原酸、异绿原酸及其异构体在栀子果皮中分布远高于果仁，也可以认为在有机酸类化合物药效方面栀子果皮比果仁效果更好，说明栀子果皮、果仁分用有一定的科学依据。

4.4 局限与不足

本试验在识别鉴定化合物过程中，缺少对照品进行对比，只能通过质谱二级碎片、保留时间、离子丰度及文献信息作为参考，推测化合物的归属，可能存在一定的假阳性结果；同时，在对比栀子果皮、果仁成分差异时，只得出西红花苷Ⅰ在栀子果仁中的相对含量更高，而西红花苷Ⅱ在栀子果皮中的相对含量更高，与文献研究结果不完全一致[17]，未使用不同产地不同批次的栀子药材，试验条件有待进一步优化；其次，本研究鉴定栀子所含有的22种化学成分都是文献中报道的已知化合物，仍存在部分离子峰没有确定归属，可通过分离纯化等手段对含量较低的成分进行富集，鉴别出更多差异化合物；在选择离子模式时，预试验图谱显示负离子模式信号强度更高，选择栀子文献中常用的负离子模式，结果可能具有片面性。

5 小结

本研究应用UHPLC-Q-Exactive/MS技术对栀子果皮、果仁不同部位中化合物进行分析与鉴定，共鉴定出22种差异具有统计学意义的化合物，其中鸡矢藤次苷甲酯、京尼平龙胆二糖苷、栀子苷、jasminodiol、西红花苷 Ⅰ 5种成分在栀子果仁中的相对含量更高，山栀苷、京尼平苷酸、栀子新苷、去乙酰车叶草苷酸甲酯、异羟栀子苷、京尼平、jasminoside B、芦丁、金丝桃苷/异槲皮苷、西红花苷Ⅰ、绿原酸、异绿原酸及其异构体等17种成分在栀子果皮中的相对含量更高。该方法的建立为中药不同部位入药的的物质基础的研究提供了一定的参考，也为栀子果皮、果仁分用的科学性及临床应用的合理性提供一定的研究基础。