基于蛋白互作和关键作用靶点的网络药理学研究白花败酱草治疗溃疡性结肠炎的作用机制及实验验证

李晓晨，王帅，2，3，李天娇，2，3，赵琳*，包永睿，2，3*，孟宪生，2，3（.辽宁中医药大学药学院，辽宁 大连 6600；2.辽宁省中药多维分析专业创新技术中心，辽宁省现代中药研究工程实验室，辽宁 大连 6600；3.辽宁省现代中药研究工程实验室，辽宁 大连 6600）

溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）是一种常见的反复发作的慢性疾病，常表现为腹痛、腹泻、便秘、便血以及炎症等。目前广泛认为肠黏膜损伤是引发UC的主要原因之一。近年来，UC发病率逐年攀升，其治疗药物主要包括美沙拉秦、盐酸小檗碱、柳氮磺胺吡啶、氨基水杨酸、糖皮质类激素等。临床治疗中发现长时间使用上述药物常会伴随着多种不良反应的发生，且停药后复发率较高，给患者带来极大的困扰[1-6]。

近年来，大量研究显示中医药在临床治疗中疗效好、毒性低[7]。因此，从中医药角度出发寻找治疗UC新药是一种可行的方法。UC的中医病名为“休息痢”，目前认为脾气虚弱为其基本病机，湿热之邪是其主要致病因素，瘀血阻滞是久病不愈的重要原因。白花败酱草[Patrinia villosa（Thunb.）Juss.]系败酱科植物，药用其全草，味辛，性寒，始载于《神农本草经》，被《本草纲目》中记载为治肠痈之要药，主要含有黄酮类、酚酸类以及皂苷类化合物，具有清热解毒，利湿排脓，活血化瘀，镇心安神的功效，临床上常用于治疗阑尾炎，痈肿疮毒，肠炎，UC，慢性胃炎，肿瘤等[8-9]。已有文献表明，败酱草在临床使用、体外实验等都具有显著的疗效，毒副作用及复发率均相对较低[5-6，10-11]。本研究采用网络药理学的研究方法，构建“潜在活性成分-作用靶点-疾病”网络对白花败酱草治疗UC靶点进行全面预测并探讨其作用机制；并在此基础上，利用自由饮用葡聚糖硫酸钠（DSS）建立的UC小鼠模型对其中筛选出的重要途径进行实验验证，深入探讨白花败酱草治疗UC的作用机制，为其进一步临床应用奠定基础。

1 材料

1.1 相关数据库

中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）[12]，有机小分子生物活性数据库（PubChem），蛋白质数据库（UniProt）[13]，GeneCard数据库，OMIM数据库，Drugbank数据库，String数据库[14]，DAVID数据库。

1.2 试药

白花败酱饮片[经辽宁中医药大学许亮教授鉴定为白花败酱Patrinia villosa（Thunb.）Juss.的干燥全草]；质谱级甲醇、乙腈（德国Merck KGaA公司）；质谱级甲酸（美国Thermo公司，批号：141831A）；纯净水（杭州娃哈哈集团有限公司）；美沙拉秦缓释颗粒（上海爱的发制药有限公司）；葡聚糖硫酸钠盐（Meilunbio公司，批号：S0925A）；TNF-α酶联免疫吸附测定试剂盒（上海科兴有限公司，批号：21071230N）；IL-6酶联免疫吸附测定试剂盒（上海科兴有限公司，批号：21071233N）；Kodak X胶片（美国柯达公司）；RIPA裂解液（ambion生物科技有限公司）；PMSF蛋白酶抑制剂、6×protein loading buffer（北京全式金生物技术有限公司）；三羟甲基氨基甲烷（Tris）、甘氨酸（Glycine）、十二烷基磺酸钠（SDS）、BCA蛋白浓度测定试剂盒（上海索莱宝生物科技有限公司）；SDS-PAGE凝胶快速配置试剂盒、飞克特超敏ECL发光液（大连美仑生物科技有限公司）；双色预染蛋白Marker（Proteintech，Cat：PL00001）；兔 抗AKT多 克隆抗体（Proteintech，Cat：10176-2-Ap）；兔抗PI3 Kinase p85（Signaling，Cat：#4292）；兔 抗Beat Actin多克隆抗体（Proteintech，Cat：20536-1-Ap）；HRP-conjugated Affinipuer Goat anti-Rabbit IgG（H＋L）（Proteintech，Cat：SA00001-2）。

1.3 动物

SPF级C57BL/6雌性小鼠，体质量（20±2）g [辽宁长生生物技术有限公司，许可证编号：SCXK（辽）2020-0001]。

1.4 仪器

旋转蒸发仪（美国SENCO公司）；Sartorius CP225D电子分析天平（北京赛多利斯天平有限公司）；CV200吉艾姆真空离心浓缩仪（北京吉艾姆科技有限公司）；组织脱水机（日本樱花：VIP6 AI）；BM450A包埋机、冻台（派斯杰）；PH60病理切片机（Lecia）；PH60组织漂烘仪（派斯杰）；GHP-9160烤箱（上海恒一）；YA0170载玻片（Solarbio）；3DHISTECH P250 FLASH全景扫描仪（3DHISTECH）；CM1900冰冻切片机（Lecia）；酶标仪（美国Molecular Drvices公司）；通用电泳仪（美国BD公司）。

2 方法与结果

2.1 网络药理学

2.1.1 药物与疾病交集靶点预测 应用TCMSP数据库平台与白花败酱草相关文献[15]，以口服生物利用度（OB）≥30%、药物相似性（DL）≥0.18为条件，筛选出活性较高的成分共12种，检索并分析其对应靶点信息；利用UniProt数据库，规范相应蛋白靶点，得到169个药物作用靶点，建立药效成分潜在作用靶点库，并构建可视化网络图，见图1。应用GeneCards、OMIM、DrugBank数据库搜索UC的作用靶点，获取相关基因1234个，构建疾病靶标库；将所得靶点信息取交集，获得药物与疾病的交集靶点98个。

图1 白花败酱草治疗UC的“活性成分-靶点”网络图Fig 1 ”Active component-target” network diagram of Patrinia villosa Juss.in treating ulcerative colitis

2.1.2 交互网络的构建和富集分析 将药材、疾病交集靶点输入蛋白交互作用网站String，生物种类选择“Homo sapiens”，最小相互作用阈值设置“medium confidence”（＞0.4），其他参数选择默认值，即可得到PPI网络，将结果进一步美化，得到交集蛋白PPI网络图[16]，其中苏氨酸蛋白激酶（AKT1）的degree值为82，在所有靶点中排列第一，表明其在整个PPI网络中占据重要地位。网络图包含98个节点，2028条相互作用，见图2；以节点大小和颜色用于反映degree值的大小，选取degree值排列前20的靶点绘制棒棒糖图，探究潜在靶基因功能，见图3；利用String和DAVID数据库对潜在基因进行功能、通路富集分析，见图4～6，结果中除人类癌症相关通路外，磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）/丝氨酸激酶（AKT）信号通路排列第一，可能是白花败酱草治疗UC的关键靶点及关键通路。已证实AKT是PI3K下游的直接靶蛋白，主要负责由PI3K始动的生物信息转导，位点被磷酸化后，结合在细胞膜上的AKT被完全激活，其首要的功能就是激活NF-κB，并诱导其释放大量的炎性因子如IL-6和TNF-α等[17]。

图2 蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络图Fig 2 Protein-protein interaction network

图3 度值排名前20的相关靶点Fig 3 Top 20 related targets in degree value

图4 BP、CC、MF三方面功能富集分析图Fig 4 Functional enrichment analysis of BP，CC，and MF

2.1.3 统计学处理 采用GraphPad Prism 7.0软件进行分析，数据以（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析统计，P＜0.05认为差异有统计学意义。

2.2 动物实验验证

2.2.1 白花败酱草药液制备 精密称取白花败酱药材粗粉约100.0 g，精密加入10倍量的70%乙醇，加热回流提取3次，每次2 h，合并提取液，减压浓缩至0.1 g·mL-1生药浓度的浸膏溶液[18]，过滤除菌分装，4℃保存备用。根据人体每日推荐剂量15.0 g/70.0 kg计算，设置白花败酱草给药组进行小鼠灌胃实验，每日0.039 g/20.0 g。

图5 通路富集分析图Fig 5 Enrichment analysis diagram of pathway

图6 活性成分-靶点-KEGG通路网络图Fig 6 Network of active ingredient-target-KEGG pathway

2.2.2 实验分组及干预方式 32只C57BL/6雌性小鼠喂养一周后，随机分为空白组、模型组、阳性药组、白花败酱草给药组，每组8只。空白组每日自由饮用自来水，其余组小鼠自由饮用3.5% DSS溶液7 d，建立UC小鼠模型，一周后饮用自来水。造模成功后，白花败酱草给药组灌胃白花败酱草提取液，阳性对照组小鼠按美沙拉秦缓释颗粒临床用量给予灌胃，空白组、模型组小鼠灌胃等体积蒸馏水，连续灌胃10 d。

2.2.3 疾病活动指数（disease activity index，DAI）评价及各组小鼠一般情况 实验期间观察小鼠体质量、大便性状和便血情况，按照三项得分进行DAI评分，DAI＝（体质量得分＋大便性状得分＋便血得分）/3，详细评分标准见表1[19]。采用DSS溶液诱导的UC小鼠模型与人类UC最为相似[20]。根据观察小鼠的体质量、大便性状，隐血、便血情况及组织学形态，符合炎症的组织病理改变，提示造模成功。与空白组小鼠相比，模型组能够引起UC小鼠的体质量减轻及总DAI指数显著升高（P＜0.01），经给药组干预后，给药组小鼠体质量呈现上升趋势、总DAI 指数呈现显著的下降趋势（P＜0.01）。表明白花败酱草与阳性药物有相同作用，能有效改善UC小鼠体质量减轻、缓解UC小鼠的症状（P＜0.01，见图7）。

表1 DAI评分标准 Tab 1 DAI scoring criteria

图7 各组小鼠DAI评分结果Fig 7 DAI score of mice in each group

2.2.4 样本采集及病理学结果 最后一次灌胃24 h后，禁食，小鼠摘眼球取血，室温下静置30 min后，3000 r·min-1离心10 min，取上清液分装，-80℃保存待测。取小鼠结肠组织，用生理盐水清洗后滤纸吸干，各组小鼠取部分结肠组织，4%多聚甲醛固定后，进行石蜡包埋，切片脱蜡，用苏木精和伊红染色，脱水封片，观察结肠组织形态。其余各组小鼠结肠组织液氮速冻，-80℃保存，备用。与空白组相比，模型组小鼠出现结肠黏膜炎症，个别部位黏膜上皮明显变薄，大量炎症细胞浸润。与模型组相比，白花败酱草给药组小鼠及阳性药物组小鼠结肠隐窝结构基本完整，炎性浸润较模型组小鼠明显减轻，上皮细胞排列较为紧密，提示白花败酱草与阳性药物具有相同治疗作用，结果见图8。

图8 不同组组织病理学结果图（×200）Fig 8 Histopathdogy of different groups（×200）

2.2.5 Western blot检测小鼠结肠组织中PI3K、AKT蛋白表达水平 每组小鼠随机抽取3只样本，取部分结肠组织，加入含有PMSF的RIPA裂解液，冰上研磨至无明显颗粒状，离心后吸取蛋白溶液，充分变性，置-20℃保存，备用。严格按照抗体说明书操作，检测小鼠结肠组织中PI3K、AKT蛋白表达水平，并用Image J软件进行定量分析。结果表明，与空白组比较，模型组小鼠结肠组织PI3K、AKT蛋白表达显著升高（P＜0.01）。与模型组比较，白花败酱草给药组与阳性药给药组小鼠结肠组织PI3K、AKT蛋白水平均下调（P＜0.01）。结果见图9。

图9 各组小鼠结肠组织中PI3K、AKT蛋白表达Fig 9 PI3K and AKT protein expression in colon tissues of mice in each group

2.2.6 ELISA法检测各组小鼠血清TNF-α、IL-6含量 将稀释后的标准品和每组随机抽取的3只待测小鼠血清样品依次加入ELISA酶标板中，每孔100 μL，每组设置3个复孔，严格按照试剂盒说明书操作，使用酶标仪在450 nm波长处检测各孔的光密度（OD值）。根据所测标准品OD值与浓度绘制标准曲线，计算各组细胞上清液中TNF-α、IL-6的水平。结果表明与空白组比较，模型组大鼠血清IL-6、TNF-α含量升高（P＜0.01）；与模型组比较，白花败酱草给药组与阳性药物组TNF-α和IL-6水平明显降低（P＜0.05，P＜0.01）。IL-6是一种多功能细胞因子，在机体免疫应答、炎症等过程中具有调节作用，在UC的发生和发展过程中，其表达水平与UC严重程度成正相关[21-22]；TNF-α，可促进活化血小板因子释放，产生氧自由基等，对肠黏膜造成伤害[23]。相关文献表明，IL-6、TNF-α的水平与UC病情具有较大的相关性[24]。基于以上结果，推测白花败酱草可能通过调控PI3K/AKT信号通路，抑制促炎因子IL-6、TNF-α的释放，达到治疗UC的目的。结果见表2。

表2 不同组ELISA实验结果 Tab 2 ELISA for different groups

3 讨论与结论

本研究利用网络药理学分析方法研究白花败酱草治疗UC的活性成分、作用靶点及相关通路，并在此基础上利用UC小鼠模型，对其中筛选出的关键通路PI3K/AKT信号通路进行验证，初步解析白花败酱草治疗UC的作用机制。

通过对白花败酱草中潜在活性成分-作用靶点-疾病网络进行分析，关键化学成分主要为槲皮素、山柰酚、木犀草素、异牡荆素、青风藤碱、谷甾醇等。相关文献表明，槲皮素能提高组织PI3K、AKT表达，阻滞细胞周期，抑制细胞增殖能力，从而起到抗炎的作用[25-26]；山柰酚通过下调PI3K、AKT的表达促进细胞凋亡[27]；木犀草素、异牡荆素主要通过降低炎症转录因子活性，抑制促炎因子TNF-α、IL-6的释放，从而发挥抗炎作用[28-30]；青风藤碱则可以减少促炎因子TNF-α、IL-6的释放[31]；谷甾醇可抑制巨噬细胞IL-6活性，减少TNF-α等炎性因子的分泌[32-34]。提示白花败酱草通过多成分、多靶点激活PI3K/AKT信号通路，发挥治疗UC的作用。

综上，通过对白花败酱草网络药理学的分析及其干预UC模型小鼠的动物实验验证，明确白花败酱草治疗UC的药理药效及作用机制，为其进一步临床应用及开发奠定基础。