重症肺炎患者血清circ_0009128 表达及其与TLR4、免疫功能的相关性研究

2022-06-30郑国平田孝瑞苗士领

实验与检验医学 2022年1期

郑国平，田孝瑞，苗士领

（河南省第二人民医院ICU，河南郑州 451191）

肺炎是临床常见的一种炎症性疾病，其主要是相关因素损伤机体后气道、肺泡等出现炎症，其中重症肺炎是指肺炎患者出现急性呼吸衰竭及终末器官功能障碍等情况，由于重症肺炎起病迅速及进展快导致患者死亡率逐年上升[1-2]。因而探究重症肺炎发生的相关分子机制对临床治疗具有重要意义。研究表明炎症反应、氧化应激在肺炎发生及发展过程密切相关[3]。重症肺炎发生过程还与机体免疫功能降低有关，其中Toll 样受体4（Toll-like receptor 4，TLR4）属于跨膜信号转导受体并可参与免疫反应[4]。相关报道指出环状RNA（circular RNA，circRNA）属于一类非编码RNA 且具有稳定性、组织特异性等特点，还可能参与神经系统疾病、心血管疾病等多种疾病发生及发展过程[5]。研究表明环状RNA_0009128 （circular RNA_0009128，circ_0009128）在活动性肺结核中呈低表达，并可能作为活动性肺结核诊断及治疗的潜在靶标[6]。但circ_0009128 在重症肺炎患者中的表达及其临床意义尚未完全阐明。因此，本研究主要探讨重症肺炎患者血清circ_0009128 的表达水平，并分析其与炎症因子、氧化指标及免疫功能的相关性。

1 资料与方法

1.1 一般资料选取2017年2月至2018年10月本院收治的重症肺炎患者90 例为重症肺炎组，其中男60 例，女30 例，年龄45～70 岁，平均年龄（55.36±8.59）岁，所有患者均符合中华医学会呼吸病学分会制定的重症肺炎诊断标准[7]。排除标准：合并恶性肿瘤患者；免疫功能障碍患者；凝血功能障碍患者；呼吸衰竭患者。选取同期普通肺炎患者80 例为普通肺炎组，所有患者均符合普通肺炎诊断标准[8]，其中男58 例，女22 例，年龄42～72 岁，平均年龄（54.69±8.96）岁。同时选取同期于本院进行体检的健康志愿者80 例为对照组，其中男55例，女25 例，年龄42～75 岁，平均年龄（55.69±9.52）岁。各组受试者一般资料比较差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。本研究经本院伦理委员会批准，所有研究对象知情且签署同意书。

1.2 方法

1.2.1 采集血液样本抽取三组研究对象入组后的空腹静脉血5 mL，4 ℃经3 000 r/min 离心10 min，吸取上清，置于-20℃冰箱内保存。

1.2.2 实时荧光定量聚合酶链反应(Quantitative Real-time PCR，qRT-PCR) 检测血清circ_0009128的表达水平采用Trizol 法（美国Invitrogen 公司）提取血清中的总RNA，应用Nanodrop2000c 超微量分光光度计检测RNA 浓度与纯度。参照反转录试剂盒说明书将总RNA 反转录为cDNA，circ_0009128 正向引物5’-CTGGCTCAATTGCTCACTGA-3’，反向引物5’-CCTCAAATGATCTGCCTGCC-3’；GAPDH 正向引物5’-AACGGATTTGGTCGTATTG-3’，反向引物5’-GGAAGATGGTGATGGGATT-3’，引物由上海生工生物工程股份有限公司设计合成。以cDNA 为模板进行qRTPCR 反应，qRT-PCR 反应体系：cDNA 2 μL，Real-Time Master Mix 10 μL，正反向引物各1 μL，RNase-Free ddH2O 补足体系至20 μL；反应条件：95 ℃5 min，95 ℃15 s，60 ℃1 min，72 ℃30 s（循环40 次）。 circ_0009128 以GAPDH 为内参，采用2-ΔΔCt法计算circ_0009128 相对表达量。反转录试剂盒与qRT-PCR 试剂盒购自美国Thermo Fisher公司。

1.2.3 检测血清炎症因子水平采用酶联免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）检测血清白细胞介素6（interleukin-6，IL-6）、白细胞介素-18（interleukin-18，IL-18）、肿瘤坏死因子-α（Tumor Necrosis Factor-α，TNF-α）的水平，检测试剂盒购自上海酶联生物科技有限公司，严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.2.4 检测血清氧化应激指标采用硫代巴比妥酸比色法检出血清过氧化脂质（lipoperoxides，LPO）水平，采用氮蓝四唑法检测血清超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）水平，检测试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司。采用改良的Hafeman 氏法检测血清谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）水平，检测试剂盒购自上海盈公酶联检测试剂有限公司，严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.2.5 评估患者肺部感染程度采用肺部感染评分（Clinical Pulmonary Infection Score，CPIS）评估患者肺部感染程度，分数越高预示肺部感染越严重[9]。

1.2.6 检测TLR4 水平与免疫球蛋白水平采用ELISA 法检测血清Toll 样受体4（Toll-like receptor 4，TLR4）水平，检测试剂盒购自北京方程佰金科技有限公司。采用免疫比浊法检测血清免疫球蛋白A（Immunoglobulin A，IgA）、免疫球蛋白G （Immunoglobulin G，IgG）、免疫球蛋白M（Immunoglobulin M，IgM）水平，检测试剂盒购自长春汇力生物技术有限公司。

1.3 统计学处理采用SPSS 21.0 统计学软件分析数据，计量资料以（±s）表示且均符合正态分布，两组间比较采用独立样本t 检验，多组间比较采用单因素方差分析；采用Pearson 法分析重症肺炎患者circ_0009128 与炎症因子、氧化应激、CPIS 评分、TLR4、免疫蛋白的相关性，P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 重症肺炎患者血清circ_0009128 表达量与对照组比较，普通肺炎组、重症肺炎组血清circ_0009128 的表达量均显著降低（P＜0.05）；与普通肺炎组比较，重症肺炎组血清circ_0009128 的表达量显著降低（P＜0.05），见表1。

表1 重症肺炎患者血清circ_0009128 表达量比较（±s）

注：与对照组比较，*P<0.05；与普通肺炎组比较，#P<0.05。

组别 n对照组普通肺炎组重症肺炎组80 80 90 F P circ_0009128 1.01±0.20 0.72±0.11*0.41±0.13*#335.969 0.000

2.2 重症肺炎患者血清炎症因子水平比较与对照组比较，普通肺炎组、重症肺炎组血清IL-6、IL-18、TNF-α 水平显著升高（P＜0.05）；与普通肺炎组比较，重症肺炎组血清IL-6、IL-18、TNF-α 水平显著升高（P＜0.05），见表2。

表2 重症肺炎患者血清炎症因子水平比较（±s，ng/L）

注：与对照组比较，*P<0.05；与普通肺炎组比较，#P<0.05。

组别 n对照组普通肺炎组重症肺炎组80 80 90 F P IL-6 IL-18 38.95±12.03 63.24±13.12*86.57±10.03*#349.180 0.000 50.32±13.25 76.35±10.02*96.57±13.20*#300.323 0.000 TNF-α 33.25±9.86 63.21±10.13*98.57±11.24*#830.925 0.000

2.3 重症肺炎患者血清氧化应激指标比较与对照组比较，普通肺炎组、重症肺炎组血清LPO 水平显著升高（P＜0.05），SOD、GSH-Px 活性显著降低（P＜0.05）；与普通肺炎组比较，重症肺炎组血清LPO 水平显著升高（P＜0.05），SOD、GSH-Px 活性显著降低（P＜0.05），见表3。

表3 重症肺炎患者血清氧化应激指标比较（±s）

注：与对照组比较，*P<0.05；与普通肺炎组比较，#P<0.05。

组别 n对照组普通肺炎组重症肺炎组80 80 90 F P LPO（μmol/L） SOD（U/L）10.20±1.23 15.52±1.03*20.03±5.20*#193.693 0.000 485.25±36.24 356.21±22.03*186.34±20.12*#2655.865 0.000 GSH-Px（U/L）126.35±12.45 95.32±10.15*45.32±9.23*#1261.870 0.000

2.4 重症肺炎患者CPIS 评分比较与普通肺炎组比较，重症肺炎组CPIS 评分显著升高（P＜0.05），见表4。

表4 重症肺炎患者CPIS 评分比较（±s）

注：与普通肺炎组比较，*P<0.05。

组别 n普通肺炎组重症肺炎组80 90 t P CPIS 评分5.16±1.45 6.23±1.32*5.036 0.000

2.5 重症肺炎患者血清TLR4 水平与免疫蛋白水平比较与对照组比较，普通肺炎组、重症肺炎组血清TLR4 水平显著升高（P＜0.05），血清IgA、IgG、IgM 水平显著降低（P＜0.05）；与普通肺炎组比较，重症肺炎组血清TLR4 水平显著升高（P＜0.05），血清IgA、IgG、IgM 水平显著降低（P＜0.05），见表5。

表5 重症肺炎患者血清TLR4 水平与免疫蛋白水平比较（±s）

注：与对照组比较，*P<0.05；与普通肺炎组比较，#P<0.05。

组别 n TLR4（ng/mL） IgA（g/L） IgG（g/L） IgM（g/L）对照组普通肺炎组重症肺炎组80 80 90 F P 3.26±1.01 6.54±1.15*8.58±1.10*#510.603 0.000 1.96±0.21 0.52±0.11*0.32±0.10*#3051.622 0.000 12.30±2.12 6.54±1.03*4.12±0.85*#722.852 0.000 1.35±0.12 1.10±0.09*0.68±0.06*#1154.329 0.000

2.6 circ_0009128 与炎症因子、氧化应激、CPIS 评分、TLR4、免疫蛋白的相关性分析采用Pearson法分析重症肺炎患者circ_0009128 与炎症因子、氧化应激、CPIS 评分、TLR4、免疫蛋白的相关性，结果显示circ_0009128 与SOD、GSH-Px、IgA、IgG、IgM 呈正相关（P＜0.05），而与IL-6、IL-18、TNF-α、LPO、CPIS 评分、TLR4 呈负相关（P＜0.05），见表6。

表6 circ_0009128 与炎症因子、氧化应激、CPIS 评分、TLR4、免疫蛋白的相关性分析（r/p）

3 讨论

circRNA 在自身免疫性疾病、炎症性疾病中表达异常并可能参与多种疾病发生及发展过程[10-11]。但circ_0009128 在重症肺炎中的表达及其作用机制尚未阐明。本研究结果显示重症肺炎患者血清circ_0009128 的表达水平显著降低，其表达量显著低于普通肺炎患者及对照组，提示circ_0009128在重症肺炎发生过程中可能发挥重要调控作用。研究表明炎症反应与氧化应激在肺炎发生及发展过程中发挥重要作用，其中IL-6、IL-18、TNF-α 可参与机体炎症反应，并可促使患者肺部受损而引发重症肺炎，LPO 属于氧自由基与多聚不饱和脂肪酸的反应产物且具有促进氧化应激的作用，SOD、GSH-Px 是过氧化物分解酶，可提高机体抗氧化能力[12-13]。本研究结果显示重症肺炎患者血清中IL-6、IL-18、TNF-α、LPO 水平显著升高，血清中SOD、GSH-Px 活性显著降低，与上述研究报道结果相似，说明重症肺炎患者体内炎症反应加重，且患者存在氧化/抗氧化失衡，即重症肺炎患者存在氧化应激反应。本研究结果显示重症肺炎患者CPIS 评分显著高于普通肺炎组患者，提示重症肺炎患者肺部感染情况明显加重。本研究采用Pearson 法分析显示circ_0009128 与SOD、GSH-Px呈正相关，而与IL-6、IL-18、TNF-α、LPO、CPIS 评分呈负相关，提示circ_0009128 与重症肺炎患者炎症反应、氧化应激反应密切相关。

重症肺炎病情发展可引起多脏器功能障碍综合征，而病原菌感染是引发肺炎的重要原因，TLRs信号通路可促进炎性细胞因子生成从而激发炎症反应，TLR4 可与其配体结合而促进炎症因子释放从而引发炎症反应[14-17]。研究表明免疫球蛋白IgA、IgG、IgM 与肺炎患者免疫功能密切相关，肺炎患者血清中IgA、IgG、IgM 水平显著降低[18-21]。本研究结果显示重症肺炎患者血清TLR4 水平显著升高，IgA、IgG、IgM 水平显著降低，与上述研究报道结果相似，提示重症肺炎患者体内存在细胞免疫功能失调。同时本研究结果显示circ_0009128 与IgA、IgG、IgM 呈正相关，而与TLR4 呈负相关，提示circ_0009128 与重症肺炎患者病情严重程度密切相关。分析原因可能为circ_0009128 表达降低可引发炎症反应及氧化应激反应，炎症反应可加重患者肺部损伤程度还可影响机体免疫功能从而导致机体抵抗能力降低最终加重肺部感染严重程度。

综上所述，重症肺炎患者血清circ_0009128的表达水平显著降低，炎症因子、LPO、TLR4 水平升高，SOD、GSH-Px 活性与IgA、IgG、IgM 水平显著降低，circ_0009128 与炎症反应、氧化应激及免疫功能密切相关，circ_0009128 表达量降低与重症肺炎发生及发展密切相关，并可能作为重症肺炎诊断及判断病情严重程度的重要指标。本研究首次检测重症肺炎患者血清circ_0009128 的表达水平，并初步分析其与疾病严重程度及病情发展的相关性，但关于其具体作用机制仍需进一步探究。