半枝莲多糖通过mTOR/P70S6K 通路对宫颈癌U14荷瘤小鼠的肿瘤抑制及诱导凋亡作用研究

高冬冬，张静，何苗

（1.驻马店市中心医院肿瘤一科，河南 驻马店 463000；2.驻马店市黄淮学院医学院，河南 驻马店 463000）

宫颈癌是女性生殖系统常见恶性肿瘤， 发病高峰为45～50 岁， 近年来发病年龄有逐渐下降趋势，严重威胁女性生命健康。 宫颈癌病因复杂，早期无明显症状，出现相应症状时已发展到中晚期，目前认为人乳头瘤状病毒 （human papillomavirus，HPV）感染是主要致病因素，HPV 疫苗可预防相关高危型HPV 感染，但价格昂贵，限制其广泛应用。临床治疗宫颈癌主要依靠手术和放化疗， 患者通过治疗，可在一定程度延长生存期，同时不可避免出现副作用，影响患者继续治疗，因此开发低廉、安全、 有效的药物对提高患者生存质量具有重要意义[1]。 半枝莲是传统中药，有清热解毒、活血化瘀、抗炎、免疫调节等作用，主治疗疮肿毒、跌打损伤及水肿等。 研究显示，半枝莲对胰腺癌、结肠癌等恶性肿瘤具有良好抑瘤作用[2]。 多糖是一种天然大分子物质，其抗肿瘤生物活性已被证实[3]。 半枝莲多糖是半枝莲主要有效活性成分之一， 含有鼠李糖、半乳糖、甘露糖等，在宫颈癌中表现出明显抗肿瘤作用[4]。 但目前关于半枝莲多糖的抗肿瘤机制尚不明确，鉴于此，本研究通过建立宫颈癌荷瘤小鼠模型， 探讨半枝莲多糖抗肿瘤作用及其可能机制，为发掘中药治疗宫颈癌提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 细胞系和实验动物 小鼠宫颈癌U14 细胞株，购自中国医学科学院北京药物研究所。

SPF 级BALA/c 雌鼠65 只，4～5 周龄， 体质量18～20 g， 购自北京维通利华实验动物技术有限公司[SCXK（京）2017-0011]。 购入后SPF 环境中适应性饲养1 周。

1.2 主要试剂和仪器 半枝莲多糖（30%）购自西安天康生物科技有限公司，溶血磷脂酸（lysophosphatidic acid，LPA） 购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，兔抗小鼠雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR） 单抗、p-pmTOR 单抗、B细胞淋巴瘤-2 （B cell lymphoma-2，Bcl-2） 单抗、Bcl-2 相 关X 蛋 白 （Bcl-2 associated X protein，Bax）单抗购自美国Abcam 公司，兔抗P70 核糖体蛋 白S6 激 酶 （P70 ribosomal protein S6 kinase，P70S6K）多抗购自美国Sant Cruze 公司，大鼠抗小鼠p-p70S6K 单抗购自美国Cell Signaling 公司，电泳仪购自美国BIO-RAD 公司。

1.3 建立荷瘤小鼠模型 建立荷瘤小鼠模型[5]：取对数增殖期U14 细胞，0.25%胰酶消化，PBS 洗涤后， 生理盐水调整细胞浓度为5×106个/mL 备用。随机抽取5 只小鼠，按0.1 mL/只腹腔接种U14 细胞， 正常饲养7～10 d 可见小鼠腹部隆起， 腹水增加，表明U14 腹水小鼠模型建立成功。 处死小鼠，无菌抽取腹水， 生理盐水稀释细胞浓度为2×106个/mL。 取60 只小鼠， 按0.1 mL/只接种于左前腋下，接种后4 d，可见肿瘤包块，接种率100%。

1.4 分组及治疗 将接种成功小鼠随机分为模型组、LPA 组、半枝莲组、半枝莲+LPA 组，每组各15只。接种成功后24 h 后进行治疗，半枝莲组灌胃半枝莲多糖3 g/kg（生理盐水溶解），1 次/d，连续14 d，末次灌胃同时尾静脉注射与LPA 组等量PBS；LPA组小鼠灌胃与半枝莲组等量生理盐水，1 次/d，连续14 d，末次灌胃同时尾静脉注射1 mg/kg 的LPA（PBS 溶解）；半枝莲+LPA 组小鼠灌胃半枝莲和尾静脉注射LPA； 模型组小鼠灌胃生理盐水和尾静脉注射PBS。

1.5 测量肿瘤大小 治疗当天开始，观察小鼠活动情况，精神状态及肿瘤生长情况，每隔1 d，使用游标卡尺测量对肿瘤长径（a）和短径（b）进行测量，根据公式计算肿瘤体积（V），V=a×b2/2，绘制肿瘤生长曲线。

1.6 检测抑瘤率 末次治疗后24 h， 处死小鼠，无菌分离各组小鼠腋下肿瘤，电子天平称重，计算抑瘤率，抑瘤率（%）=（模型组瘤质量-治疗组瘤质量/模型组瘤质量）×100%。

1.7 检测肿瘤组织细胞凋亡和细胞周期 每组随机取5 只小鼠肿瘤组织， 制备肿瘤组织悬液，300目滤网过滤， 离心洗涤3 次， 调整细胞浓度为1×106个/mL，放入预冷的70%乙醇中4 ℃固定12 h，离心弃上清液， 预冷PBS 重悬细胞后， 加入RNA酶（Rnase）PI 染色液37 ℃避光染色30 min，之后再流式细胞仪激发波长488 nm 处检测，检测肿瘤细胞凋亡情况和细胞周期。

1.8 HE 染色观察肿瘤组织组织学变化 称重后，每组随机取5 只小鼠肿瘤组织放置于10%中性甲醛中，4 ℃固定48 h，梯度浓液乙醇对组织脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，切片机切片，片厚约4 μm，常规苏木素、伊红染色，脱水、透明、封片，光学显微镜下观察肿瘤组织学形态。

1.9 免疫组化检测肿瘤组织Bax 和Bcl-2 表达 取肿瘤组织切片，脱蜡水化后，PBS 冲洗；放入枸橼酸钠缓冲液15 min 进行抗原修复，PBS 冲洗； 加入3% H2O2室温孵育10 min，消除内源性过氧化物酶活性；加入50 μL 样品血清室温孵育15 min；加入兔抗小鼠Bax 和Bcl-2 一抗，4 ℃孵育过夜，PBS洗涤；加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗，37 ℃孵育30 min，PBS 洗涤；DAB 显色； 苏木素复染，梯度浓度乙醇脱水，二甲苯透明，封片，光学显微镜下观察染色结果， 每张切片随机选取5 个视野，计算阳性表达率，阳性表达率（%）=阳性表达细胞数/细胞总数×100%。

1.10 Western blot 检测肿瘤组织mTOR、p-mTOR、P70S6K、p-P70S6K 蛋白表达 各组剩余肿瘤组织保存于液氮中， 取100 mg 液氮中保存肿瘤组织，加入RIPA 液裂解，12000 r/min 离心20 min（离心半径10 cm），取上清液，采用BCA 法测定蛋白浓度，100 ℃加热使蛋白变性， 定量后， 进行SDSPAGE 电泳， 电泳结束后将蛋白转至PVDF 膜上，加入适量封闭液封闭2 h，TBST 洗膜，将膜放入1∶1000 稀释的mTOR、p-mTOR、P70S6K、p-P70S6K一抗中4 ℃孵育过夜，TBST 洗膜， 放入1∶4000 稀释的HRP 标记的二抗中室温孵育2 h，TBST 洗膜，加入ECL 化学发光剂，曝光显影，使用Image J 软件分析蛋白条带灰度值， 以目的蛋白条带灰度值/内参β-actin 蛋白条带灰度值的比值，作为目的蛋白相对表达水平。

1.11 统计学方法 采用SPSS 22.0 软件处理数据，符合正态分布的计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用LSD-t 检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠一般情况观察 荷瘤小鼠在注射U14 细胞后4 d 腋下出现肿瘤，小鼠弓背、脱毛，精神萎顿，行动迟缓，活动减少，反应迟钝，其中半枝莲组小鼠上述状态程度最轻。

2.2 各组小鼠肿瘤生长曲线 模型组肿瘤体积随时间延长之间逐渐增加；LPA 组较模型组肿瘤生长更快；半枝莲组肿瘤生长明显减慢；半枝莲+LPA组肿瘤生长较模型组慢，但较半枝莲组快。见图1。

图1 各组小鼠肿瘤生长曲线

2.3 各组小鼠肿瘤质量和抑瘤率 瘤质量和抑瘤率组间比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。 与模型组比较，LPA 组瘤质量增加， 半枝莲组、 半枝莲+LPA 组瘤质量减小（P＜0.05）；与LPA 组比较，半枝莲组、半枝莲+LPA 组瘤质量减小，抑瘤率升高（P＜0.05）；与半枝莲组比较，半枝莲+LPA 组瘤质量增加，抑瘤率降低（P＜0.05）。 见表1。

表1 各组小鼠瘤质量和抑瘤率（±s，n=15）

表1 各组小鼠瘤质量和抑瘤率（±s，n=15）

注：与模型组比较，aP<0.05；与LPA 组比较，bP<0.05；与半枝莲组比较，cP<0.05。

组别 瘤质量（g）模型组LPA 组半枝莲组半枝莲+LPA 组F 值P 值2.53±0.15 2.92±0.17a 1.27±0.13ab 1.86±0.14abc 363.072＜0.001抑瘤率（%）—-15.41±1.87 49.80±2.01b 26.48±1.98abc 428.236＜0.001

2.4 各组小鼠肿瘤组织细胞周期和细胞凋亡率G0/G1 期、S 期细胞及凋亡率组间比较， 差异有统计学意义（P＜0.05）。 与模型组比较，LPA 组G0/G1期细胞减少，S 期细胞增加，凋亡率降低，半枝莲组和半枝莲+LPA 组G0/G1 期细胞增加，S 期细胞减少，凋亡率升高（P＜0.05）；与半枝莲组比较，半枝莲+LPA 组G0/G1 期细胞减少，S 期细胞增加，凋亡率降低（P＜0.05）。 各组G2/M 期细胞比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。 见表2。

表2 各组小鼠肿瘤组织细胞周期和细胞凋亡率（±s，n=15）

表2 各组小鼠肿瘤组织细胞周期和细胞凋亡率（±s，n=15）

注：与模型组比较，aP<0.05；与LPA 组比较，bP<0.05；与半枝莲组比较，cP<0.05。

组别 G0/G1（%）模型组LPA 组半枝莲组半枝莲+LPA 组F 值P 值35.59±3.26 22.38±2.67a 65.97±4.15ab 43.16±3.57abc 139.935＜0.001 S（%） G2/M（%）43.83±3.75 54.08±3.34a 12.83±2.11ab 32.72±2.93abc 163.068＜0.001 20.58±2.61 23.44±3.85 21.38±2.86 24.12±2.72 1.503 0.252凋亡率（%）8.21±3.05 3.16±1.78a 45.69±3.57ab 24.85±3.32abc 203.317＜0.001

2.5 各组小鼠肿瘤组织学观察结果 HE 染色显示，模型组肿瘤组织细胞数量丰富，排列密集，核大深染，核异型，核浆比例高，无明显萎缩坏死现象；LPA 组与模型组形态相似， 肿瘤细胞生长良好；半枝莲组可见凋亡细胞，数量明显减少，核碎裂，出现萎缩、坏死现象；半枝莲+LPA 组较模型组细胞数量减少，但较半枝莲组多，可见少量萎缩坏死细胞。 见图2。

图2 肿瘤组织HE 染色结果（×400，A：模型组；B：LPA 组；C：半枝莲组；D：半枝莲+LPA 组）

2.6 各组小鼠肿瘤组织Bcl-2、Bax 蛋白表达水平肿瘤组织Bcl-2、Bax 阳性表达率组间比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。 与模型组比较，LPA 组Bcl-2 阳性表达率升高，Bax 阳性表达率降低， 半枝莲组、半枝莲+LPA 组Bcl-2 阳性表达率降低，Bax 阳性表达率升高（P＜0.05）；与半枝莲组比较，半枝莲+LPA 组Bcl-2 阳性表达率升高，Bax 阳性表达率降低（P＜0.05）。 见图3。

图3 肿瘤组织Bcl-2、Bax 蛋白表达免疫组化结果（×400，A：模型组；B：LPA 组；C：半枝莲组；D：半枝莲+LPA 组）

2.7 各组小鼠肿瘤组织mTOR、p-mTOR、P70S6K、p-P70S6K 蛋白表达水平 肿瘤组织p-mTOR、p-P70S6K 蛋白表达组间比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。与模型组比较，LPA 组p-mTOR、p-P70S6K 蛋白表达增加，半枝莲组和半枝莲+LPA 组p-mTOR、p-P70S6K 蛋白表达减少（P＜0.05）；与半枝莲组比较， 半枝莲组+LPA 组p-mTOR、p-P70S6K 蛋白表达增加（P＜0.05）。 各组mTOR、P70S6K 蛋白表达比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。 见表3、图4。

表3 各组小鼠肿瘤组织mTOR、p-mTOR、P70S6K、p-P70S6K 蛋白表达（±s，n=5）

表3 各组小鼠肿瘤组织mTOR、p-mTOR、P70S6K、p-P70S6K 蛋白表达（±s，n=5）

注：与模型组比较，aP<0.05；与LPA 组比较，bP<0.05；与半枝莲组比较，cP<0.05。

组别 mTOR模型组LPA 组半枝莲组半枝莲+LPA 组F 值P 值1.13±0.12 1.15±0.11 1.11±0.13 1.12±0.11 0.105 0.956 p-mTOR P70S6K 0.84±0.08 0.98±0.09a 0.48±0.06ab 0.71±0.07abc 39.268＜0.001 0.95±0.11 0.93±0.12 0.92±0.11 0.97±0.10 0.202 0.893 p-P70S6K 0.72±0.08 0.89±0.09a 0.37±0.05ab 0.59±0.06abc 48.414＜0.001

图4 肿瘤组织mTOR、p-mTOR、P70S6K、p-P70S6K 蛋白表达（A：模型组；B：LPA 组；C：半枝莲组；D：半枝莲+LPA 组）

3 讨论

动物性移植肿瘤模型的建立对于研究肿瘤治疗具有重要意义， 其作为体内抗肿瘤药物筛选的有效方式，具有接种成功率高、个体差异小、实验周期短等优点，易于客观判断药物疗效[6]。 本研究采用皮下移植瘤模型，均接种成功，接种后第4 天可见小鼠左前腋下接种部位隆起，随时间延长，包块逐渐增大，肿瘤无自行消退，而使用半枝莲干预的小鼠，肿瘤生长趋势明显低于模型组，提示宫颈癌荷瘤小鼠模型建立成功。

肿瘤细胞具有无限增殖能力， 通过影响或调节细胞周期，可抑制肿瘤生长，发挥抗肿瘤作用[7]。细胞凋亡对维持机体自身稳定至关重要，在肿瘤发生发展过程中发挥负调控作用， 通过诱导细胞凋亡，阻滞肿瘤生长，是抗肿瘤的有效途径之一[8-9]。 化学药物在杀死肿瘤细胞的同时， 可导致机体免疫力下降，植物中的多糖成分副作用相对较小，临床已被成功用于抗肿瘤治疗[10-11]。 研究显示，多糖可通过阻滞细胞周期及诱导凋亡等途径发挥抗肿瘤作用[12-13]。Li 等[14]报道，半枝莲多糖对肝癌荷瘤小鼠具有明显抑瘤作用。Jin 等[15]研究表明，半枝莲可抑制结直肠癌细胞迁移和侵袭，从而发挥抗癌作用。另有研究显示， 半枝莲和白花蛇舌草配伍可降低肿瘤细胞糖酵解水平， 抑制胰腺荷瘤小鼠肿瘤生长[16]。 本研究半枝莲组小鼠肿瘤体积较模型组减小，抑瘤率达49.80%，G0/G1 期细胞显著增多，S 期细胞显著减少，凋亡率升高，且病理组织学检查显示肿瘤细胞数量减少，发生萎缩和坏死，提示半枝莲多糖将肿瘤细胞阻滞在G0/G1 期， 延长细胞周期，减少参与分裂细胞数，促进凋亡，发挥抑瘤作用。

mTOR 参与细胞增殖、 代谢和分化等过程中，通过磷酸化活化下游的P70S6K 发挥生物学作用[17]。 mTOR/P70S6K 信号通路与癌细胞生长、增殖密切相关，卵巢癌、食管癌等多种恶性肿瘤发生发展过程中均存在mTOR/P70S6K 信号通路调节异常[18-19]。Bcl-2 表达水平与恶性肿瘤发展关系密切，Bcl-2 可抑制细胞凋亡，Bax 为Bcl-2 同源基因，对细胞具有促凋亡作用。 mTOR/P70S6K 信号通路活化可增加Bcl-2 表达， 减少细胞凋亡， 抑制TOR/P70S6K 信号通路，可作为抗肿瘤靶点。 LPA 参与细胞多种生理病理过程，可通过竞争性结合，激活mTOR[20]。 本研究采用LPA 干预后，p-mTOR 和p-P70S6K 蛋白表达明显增加，Bcl-2 表达较高，Bax表达较低，病理学显示癌细胞生长良好，提示TOR/P70S6K 信号通路被激活，促进肿瘤细胞增殖；而使用半枝莲多糖治疗后， 各项指标与LPA 呈相反趋势； 在使用半枝莲多糖治疗后同时使用LPA，pmTOR 和p-P70S6K 表 达 升 高，Bcl-2 表 达 升 高，Bax 表达降低， 半枝莲多糖的抑瘤作用明显下降，提示半枝莲多糖可能通过抑制TOR/P70S6K 信号通路，阻滞细胞停留在G1/G0 期，调控凋亡基因表达，促进细胞凋亡，发挥抑瘤作用。

综上所述， 半枝莲多糖对宫颈癌荷瘤小鼠具有明显抑制肿瘤生长作用， 可能与抑制TOR/P70S6K 信号通路调节细胞周期，促进细胞凋亡有关，为临床治疗宫颈癌提供实验依据。