钙卫蛋白在类风湿关节炎诊断中的应用及其潜在的临床价值

项羽羚，谭立明

（1.鹰潭市人民医院检验科，江西 鹰潭 335000；2.南昌大学第二附属医院 江西省医学重点实验室，江西 南昌 330006）

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA),是 一种病因未明的、 以炎性滑膜炎为主的慢性系统性自身免疫病[1-2]。 其主要特征是小关节、多关节的对称性、侵袭性关节炎症[3]，治疗原则主要为早发现、早治疗。经典的RA 可以通过实验室指标结合影像学和临床症状确诊，但RA 变化多样，部分不典型的早期以及血清学指标阴性的患者常存在漏诊、误诊，故需要寻找新的指标来完善RA 的诊断。 通过文献学习发现钙卫蛋白在RA 患者血清及滑膜液中显著升高[4-5]，提示钙卫蛋白可能参与RA 疾病的发生。 钙卫蛋白是由S100A8 和S100A9 两种钙结合蛋白组成的异源二聚体。 作为一种炎症性蛋白质，广泛存在于中性粒细胞和吞噬细胞中，参与人体生理代谢， 负责大部分蛋白质生物间的相互作用[6-8]。 本研究通过检测钙卫蛋白在RA 组、非RA 组和健康对照组中表达水平以及钙卫蛋白水平和疾病活动程度之间的联系， 评价钙卫蛋白在RA 患者中的诊断价值。 研究RA 与抗突变型瓜氨酸化波形蛋白 （anti-mutant citrullinated vimentin,anti-MCV)、 类风湿性关节因子(rheumatoid factor,RF)和抗环瓜氨酸多肽抗体(anti-cyclic citrullinated peptide antibody, anti-CCP)联合诊断的价值。 本研究对南昌大学第二附属医院和鹰潭市人民医院183例RA 患者组、144 例非RA 组和48 例健康对照组进行钙卫蛋白、anti-MCV、RF 和anti-CCP 检测，结果进行分析和比较，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2020年1月至2020年12月在南昌大学第二附属医院和鹰潭市人民医院确诊的RA 患者183 例为RA 组，56 例骨关节炎（OA）、46 例痛风性关节炎(GA)和42 例强直性脊柱炎（AS)共同组成144 例非RA 组，48 例健康受试者为对照组，所有患者均符合指南诊断标准[9-13]。所有标本均知情同意， 并经南昌大学第二附属医院和鹰潭市人民医院伦理委员会批准。 根据欧洲风湿病联合会推荐的RA 疾病活动指数DAS28 评分[14]，将RA 组患者分为四个亚组： 高疾病活动组 （n=42，DAS28＞5.1 分）、 中等疾病活动组 （n=48，3.2 分＜DAS28≤5.1 分）、 低疾病活动组 （n=39，2.6 分≤DAS28≤3.2 分）、缓解组（n=54，DAS28＜2.6 分）。

1.2 纳入标准 符合以下所有条件予以纳入：（1）签署知情同意协议；（2）诊断明确，影像学、临床资料完善；（3）无合并其他自身免疫性疾病；（4）健康体检者检验结果无异常。

1.3 排除标准 符合以下其中之一条件予以排除：（1）患有其他自身免疫性疾病；（2）患有某些内分泌疾病；（3）患有心血管疾病；（4）妊娠和哺乳期妇女。

1.4 临床资料 获取183 例RA 患者组、144 例非RA 组及48 例健康对照组的临床资料， 包括疾病持续时间、性别、年龄、晨僵持续时间、28 肿胀和疼痛关节计数(28-SJC 和28-TJC)、疼痛持续时间、患者全身模拟评分(100-mmVAS)。

1.5 方法

1.5.1 标本采集与保存 采集实验对象空腹静脉血3 mL,采用分离凝胶加速采血管收集，静置30 min,TD6M 台式低速离心机，2 500 r/min 离心15 min。-80 ℃保存备用，避免反复冻融。

1.5.2 钙卫蛋白、anti-MCV、RF 和anti-CCP 的定量测定 取出保存血清标本，ELISA（上海恒远生化试剂有限公司） 三重复检测钙卫蛋白和anti-MCV水平；全自动特定蛋白仪PA200（深圳市金瑞生物科技有限公司） 速率散射比浊法检测RF 水平；贝克曼库尔特AU5800 （中汉盛泰生物技术有限公司）速率散射比浊法检测anti-CCP 水平。计算各指标的曲线下面积(area under curve，AUC)、 敏感度（sensitivity，Se)、特异度（specificity，Sp)、准确度(accuracy)、约登指数（youden index，YDI)、阳性预测值(positive predict value，PPV)、 阴性预测值(negative predict value，NPV)、阳性似然比(+LR) 和阴性似然比(-LR)各指标。 以上所有操作严格遵守各试剂盒和仪器使用说明书及南昌大学第二附属医院和鹰潭市人民医院检验科质量管理手册。

1.6 统计处理采用SPSS 23.0 软件进行数据统计、处理及分析 计量资料采用K-S 检验和Levene's检验分别对数据正态性和方差齐性进行检验,正态分布用±s 表示，偏态分布用中位数（四分位数间距）[M(QR)]的方式表示。多组正态分布资料比较用One- way ANOVA 检验；偏态分布资料组间水平差异采用非参数Kruskal-Wallis 检验，绘制受试者工作曲线(ROC)，利用logistic 回归模型建立2 个指标联合，通过曲线下面积(AUC)评估钙卫蛋白诊断RA 的价值; 实验室相关检测指标之间相关性采用Pearson 相关分析，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组一般资料 与非RA 组和健康对照组相比，RA 组的钙卫蛋白显著升高（P＜0.01）。组间年龄和性别无显着差异（P＞0.05）。 见表1。

表1 各组间基本资料

2.2 不同RF 水平组的RA 组钙卫蛋白水平 不同RF 组的钙卫蛋白水平RA 组根据RF 的诊断截断值（20 ng/mL）进一步分为两个亚组，即RF 水平高于截断值的RF 阳性组和RF 水平低于RF 截断值的RF 阴性组。RF 阳性组的钙卫蛋白水平显著高于RF 阴性组，且均高于健康对照组（P＜0.01）。 见表2。

表2 各组钙卫蛋白水平

2.3 RA 组不同活动度钙卫蛋白水平 RA 组中高疾病活动组、中疾病活动组、低疾病活动组、缓解组钙卫蛋白水平分别为 (950.66±117.82)pg/mL、(771.68 ±81.38)pg/mL、 (593.96 ±98.62)pg/mL 和（492.89±207.76）pg/mL， 各组之间的统计差异，见图1A。 通过Pearson 相关分析， 钙卫蛋白水平与DAS28 评分呈正相关（r=0.572，P＜0.01），见图1B。

图1 A：箱线图显示不同RA 活动和健康对照的钙卫蛋白水平。B：钙卫蛋白与DAS28 相关性.DSA28, 关节疾病活动评估之间的相关性。

2.4 钙卫蛋白、anti-MCV、RF 和anti-CCP 检测结果临床评价 各指标中钙卫蛋白的特异性最高，RF的灵敏度最高，anti-MCV 的灵敏度和特异性均比较高，见表3。

表3 钙卫蛋白、anti-MCV、RF 和anti-CCP 检测结果临床评价

2.5 钙卫蛋白结果的ROC 曲线分析 通过计算得到钙卫蛋白曲线下面积0.844,其95%CI 为0.792～0.897，达到中等诊断价值，对应cutoff 值为584 ng/mL，见图2A、图2C；钙卫蛋白、anti-MCV、RF 和anti-CCP 联合诊断RA 的ROC 曲线见图2B、图2D。

图2 A：钙卫蛋白、anti-MCV、RF 和anti-CCP 诊断RA 的特异性和敏感性B：钙卫蛋白分别联合anti-MCV、RF 和anti-CCP 诊断RA 的特异性和敏感性。C：各指标的ROC 结果。D：指标联合检测ROC 结果。95%CI：95%置信区间。 anti-MCV，抗突变瓜氨酸波形蛋白；RF，类风湿因子；anti-CCP,抗环瓜氨酸多肽抗体；AUC，曲线下面积；ROC，受试者工作特征。

3 讨论

RA 主要的病理特征有关节滑膜持续炎症性增生、血管翳形成[15]，其经典实验室指标主要有RF和anti-CCP。 现阶段尚无能逆转该病的特效药，该病严重危害人民的健康，造成巨大的经济负担。 钙卫蛋白属于S100 蛋白家族中的一种[16]，主要表达于树突状细胞、中性粒细胞、巨噬细胞、血管内皮细胞等，在健康人群中就可以检测出来。 作为一种炎性蛋白，在炎症期间，主要是从坏死或者活化的中性粒细胞、单核巨噬细胞中释放，参与多种自身免疫性疾病的致病过程[17-18]。 比如炎性肠病、特发性关节炎、多发性硬化症等，钙卫蛋白主要是通过与晚期糖基化终产物受体和Toll 样受体-4 结合而发挥作用， 同时还可加速骨小梁的构建和软骨基质的钙化。有文献明确了钙卫蛋白在不同RA 活动度中表达存在差异[19]，提示钙卫蛋白很可能参与了RA 的发病进程。

本研究结果显示RA 组钙卫蛋白水平明显高于非RA 组和健康对照组，非RA 组结果显著高于健康对照组，RA 组结果也明显高于OA、GA、AS组，表明在炎性关节病变中，尤其是RA 患者中钙卫蛋白确有升高，可能与疾病发生机制相关。 按照DAS28 评分分组结果显示：高疾病活动组、中疾病活动组、低疾病活动组均高于健康对照组，且各组之间具有显著差异（P＜0.05)；缓解组和健康对照组差异无统计学意义（P＞0.05)。 说明钙卫蛋白在RA不同活动度中表达存在显著差异，和RA 疾病发展进程呈正相关,与Van Hoovels L 等[20]的结论基本一致，由此可以判断钙卫蛋白水平可以用于RA 疾病的诊断及病情发展评估。

将RA 组分成RF 阳性组和RF 阴性组， 比较RF 阳性组、RF 阴性组、 健康对照组和非RA 组钙卫蛋白水平， 结果显示RF 阳性组和RF 阴性组钙卫蛋白水平显著高于健康对照组和非RA 组。 与Bae S.C 等[21]结论基本相符。 在RF 阳性RA 患者中，RF 和钙卫蛋白水平显著升高，提示钙卫蛋白可以辅助RF 诊断RA，提高诊断准确性；在RF 阴性RA 患者中，钙卫蛋白水平升高，提示钙卫蛋白检测可避免漏诊； 同时可以和非RA 组疾病区分，避免误诊。 钙卫蛋白拟为RF 阴性的RA 患者的诊断增加新的靶点，从而为RA 患者早期诊断、鉴别诊断、发展进程评估提供新的思路。

经ROC 曲线分析,钙卫蛋白、anti-MCV、RF 和anti-CCP 的AUC 面积 分 别 为0.844、0.914、0.894和0.885，anti-MCV 的AUC 面积最高，钙卫蛋白的AUC 面积接近经典指标RF、anti-CCP,表明钙卫蛋白同经典指标一样有较好的诊断价值； 钙卫蛋白联合anti-MCV、RF 和anti-CCP 诊断RA 的AUC面积分别为0.953、0.947 和0.917,诊断效能进一步增强，略高于Zhu J 等[22]结论，可能和试剂厂家不同有关。 从4 组指标临床评价分析， 当截断值为584ng/mL 时, 钙卫蛋白对RA 诊断的灵敏度和特异性分别为65.67%、89.72%,其中钙卫蛋白的阳性预测值(0.909)、阳性似然比(6.669)、特异性(89.72%)均高于其他3 组，阳性预测价值较高；RF 的灵敏度为88.53%、阴性预测值为0.806，均高于其他3 组,阴性预测价值较高， 但RF 在老年人和其他自身免疫性疾病患者血清中也会升高，造成其特异性不高[23-24]；anti-MCV 的约登指数为0.675，高于其他3 组，诊断价值较高。 Van Hoovels L 等[25]研究指出， 钙卫蛋白可以在经典指标RF 和anti-CCP 阴性情况下显著升高，具有很高的特异性，通过联合诊断，可以提高RA 的诊断效能。

综上所述，钙卫蛋白检测对RA 患者的诊断和鉴别诊断具有临床意义， 并且联合RF、anti-CCP和anti-MCV 能进一步提高诊断价值，有望成为辅助诊断RA 患者的一个新的实验指标； 同时其与RA 患者临床疾病活动度之间存在密切关系，对评估和监测RA 患者病情有重要的指导和参考意义。