血清1-甲基-2-吡啶酮-5-羧酰胺、5,6-二氢胸腺嘧啶、胆绿素水平与哮喘儿童肺功能的相关性*

张称心，李琳琳，张艳波

内蒙古医科大学附属医院儿科，内蒙古呼和浩特 010050

哮喘是一种慢性呼吸系统疾病，各年龄段人群均有发病，其特征是气喘、胸闷、呼吸短促和咳嗽的发作[1]。根据美国疾病控制与预防中心2016年的报告，5～11岁和12～17岁儿童的哮喘患病率分别为9.6%和10.5%[2]。在中国，哮喘是儿童中常见的慢性疾病，给家庭带来了严重的负担[3]。许多物质已经被确定为哮喘的影响因素，但这些物质如何影响疾病仍不清楚[4]。代谢组学是对生物系统中所有代谢物(包括碳水化合物、肽、氨基酸、有机酸、核苷酸和脂类)进行系统分析的学科，它已成为诊断疾病新生物标志物的有效工具，并可能帮助识别与复杂疾病相关的新途径[5]。与转录、翻译或翻译后的变化相比，代谢物可能是更准确的疾病标志物，因为它们水平的变化代表了一种整合的病理生理学特征，是遗传和环境相互作用的结果[6]。已有研究发现，哮喘儿童血清中1-甲基-2-吡啶酮-5-羧酰胺(2PY)、5,6-二氢胸腺嘧啶(DHT)、胆绿素(BV)水平异常[7]，但是这种异常是否与肺功能相关仍然未知。基于此，本研究探讨哮喘儿童血清2PY、DHT、BV水平与肺功能的关系，以及3种指标对哮喘的诊断价值。

1 资料与方法

1.1一般资料 选择2018年11月至2021年4月本院收治的哮喘儿童100例为哮喘组，选择同时期体检的健康儿童100例为对照组。纳入标准：(1)哮喘患儿符合《儿童支气管哮喘诊断与防治指南(2016年版)》[8]。具体表现如下：①多于每月1次的频繁发作性喘息；②活动诱发的咳嗽或喘息；③非病毒感染导致的间歇性夜间咳嗽；④喘息症状持续至3岁以后；⑤抗哮喘治疗有效，但停药后又复发。(2)哮喘患儿家属知情同意并签订知情同意书。排除标准：(1)早产儿；(2)无法配合完成本研究检测者；(3)先天性呼吸道疾病者。对照组与哮喘组一般资料的比较见表1，两组性别比例、年龄和母乳喂养比例差异无统计学意义(P>0.05)，但有家族过敏史比例、用力肺活量(FVC)比较，差异有统计学有意义(P<0.05)。本研究经过本院伦理委员会批准。

表1 两组一般资料比较

1.2方法 入院时检测两组受试者的FVC、第1秒用力呼气容积(FEV1)、75%呼气中期流量(MEF75%)、50%呼气中期流量(MEF50%)、25%呼气中期流量(MEF25%)和最大呼气流量(PEF)。采集哮喘组入院时治疗前及对照组体检时的肘前静脉血4 mL后分离血清。依据标准品2PY(RH125152，BIORULER)、DHT(T0532，TOPSCIENCE)、BV(RH106781，BIORULER)使用质谱检测血清中各指标水平。质谱检测的主要步骤如下：将100 μL的样品与100 μL水和800 μL甲醇混合，并在-20 ℃下孵育10 min脱蛋白。以 13 000×g离心10 min后，将脱蛋白的上清液转移到干净的塑料离心管中。使用真空 SpeedVac 蒸发器在45 ℃下蒸发溶剂3 h。将干燥的残留物溶解在100 μL 95%乙腈中，并加入 0.1%甲酸。然后使用Bandelin RM 40UH 清洗机对样品进行超声处理5次，每次持续30 s，以更好地溶解残留物。然后将样品以13 000×g离心10 min，所得上清液用于质谱分析。使用配备电喷雾电离源的 MicroTOF-Q 混合四极杆飞行时间质谱仪进行质谱分析。质谱仪设置为优先检测质荷比(m/z)为50～1 000的离子，质量准确度为 (2～4)ppm。在正负离子电荷检测模式下记录光谱。使用连接到注射泵的玻璃注射器将样品注入电喷雾电离源。样品到电离源的流速为180 μL/h，样品以随机顺序注射。使用DataAnalysis 程序从质谱峰确定离子代谢物的质量。选择所有高于噪音水平的峰值。如果两个峰的相对分子质量差异不超过0.01，则认为两个峰与同一代谢物相关所得质谱数据的二元矩阵用于进一步分析。使用Matlab v.12程序进行质谱处理。

2 结 果

2.1哮喘组和对照组肺功能指标比较 哮喘组FVC、FEV1、MEF75%、MEF50%、MEF25%、PEF均低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 哮喘组和对照组肺功能指标比较

2.2哮喘组和对照组血清2PY、DHT、BV水平比较 哮喘组血清2PY、DHT、BV水平均高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，见表3。

表3 哮喘组和对照组血清2PY、DHT、BV水平比较

2.3血清2PY、DHT、BV水平与肺功能指标的相关性 采用Pearson相关对2PY、DHT、BV水平与肺功能指标的相关性进行分析，发现2PY、DHT、BV水平与FVC、FEV1、MEF75%、MEF50%、MEF25%、PEF均呈负相关(P<0.05)，见表4。

表4 血清2PY、DHT、BV水平与肺功能指标的相关性(r)

2.4影响儿童哮喘发生的多因素Logistic回归分析 以是否发生儿童哮喘为因变量(是=1，否=0)，以年龄、性别、体质量指数(BMI)、2PY、DHT、BV水平、婴幼儿期使用抗菌药物、母乳喂养、有家族过敏史为自变量进行Logistic回归分析。结果显示，2PY高水平儿童的发病风险是低水平的8.145倍，DHT高水平儿童的发病风险是低水平的7.258倍，BV高水平儿童的发病风险是低水平的8.617倍，婴幼儿期使用抗菌药物的发病风险是未使用的2.477倍，有家族过敏史的发病风险是无家族过敏史的3.405倍，而年龄、性别、BMI、母乳喂养并不是儿童哮喘发生的风险因素，见表5。

表5 影响儿童哮喘发生的多因素Logistic回归分析

2.5血清2PY、DHT、BV水平对儿童哮喘的诊断价值 ROC曲线分析结果显示，2PY诊断儿童哮喘的曲线下面积(AUC)为0.94(95%CI： 0.915 2～0.990 4)；DHT诊断儿童哮喘的AUC为0.93(95%CI：0.920 4～0.973 5)；BV诊断儿童哮喘的AUC为0.95(95%CI：0.921 7～0.989 4)。见表6。

表6 血清中2PY、DHT、BV水平诊断儿童哮喘的价值分析

3 讨 论

本研究通过检测血清2PY、DHT、BV水平与肺功能的相关性，发现2PY、DHT、BV水平与FVC、FEV1、MEF75%、MEF50%、MEF25%、PEF均呈负相关(P<0.05)，并且2PY、DHT、BV高水平是儿童哮喘发生的风险因素。血清2PY、DHT、BV诊断儿童哮喘的灵敏度分别为92.0%、89.0%、97.0%，特异度分别为94.0%、90.0%、91.0%。提示血清2PY、DHT、BV水平可作为诊断儿童哮喘的潜在标志物。

本研究结果显示，哮喘组中烟酰胺途径代谢产物2PY水平高于对照组(P<0.05)。相关研究显示，烟酸和烟酰胺代谢途径与哮喘表型有关[9]。一项对人类气道平滑肌的体外研究表明，来自哮喘供体的细胞烟酰胺腺嘌呤二磷酸(NADPH)氧化酶的表达增加，从而促进氧化应激和平滑肌细胞的收缩[10]。另有研究结果显示，中性粒细胞性哮喘患者NADPH氧化酶表达增加，同时支气管上皮纤毛功能降低[11]。这些体外模型为本研究观察到的血浆烟酰胺代谢物与当前哮喘之间的关系提供了生物学基础。

本研究发现，哮喘组血清BV水平均高于对照组(P<0.05)。BV是哮喘儿童中产生的一种代谢物，是胆汁的成分之一[12]。相关研究表明，血红素加氧酶(血红素中产生BV的酶)的活性可能会对呼吸道的黏液分泌产生影响[13]。对健康人支气管上皮细胞的研究结果显示，血红素加氧酶的过表达与白细胞介素(IL)-13诱导的杯状细胞减少和黏蛋白MUCA5分泌减少有关[14]。哮喘患者血清BV水平的降低可能反映血红素加氧酶的活性降低，这可能有助于气道黏液分泌的增加。

与对照组相比，哮喘组血清DHT水平升高提示哮喘患儿的嘧啶代谢可能发生改变，这可能与哮喘的病理生理学有关。一项针对哮喘患儿的大型代谢组学研究表明，嘧啶代谢物与哮喘的3个表型(甲胆碱反应性、支气管扩张剂使用前FEV1/FVC和支气管扩张剂使用后FEV1/FVC)之间存在关联[15]。然而，嘧啶代谢与影响哮喘的生理过程之间的联系尚不清楚，值得进一步研究。

本研究发现婴幼儿期使用抗菌药物其哮喘的发病风险是未使用的2.477倍，有家族过敏史的发病风险是无家族过敏史的3.405倍。过敏可能是儿童哮喘发生的一个重要因素，因为与轻度哮喘患儿相比，患有更严重哮喘患儿更具有特应性，并且往往暴露于更高水平的过敏原中[16]。家族过敏史是儿童哮喘的重要风险因素，越来越多的证据表明过敏具有遗传风险[17]。因此，遗传因素确实在儿童哮喘风险中发挥重要作用，儿童哮喘与遗传关系密切。

综上所述，血清2PY、DHT、BV水平与肺功能具有相关性，其可作为诊断儿童哮喘的潜在标志物。