111例无菌体液标本中CRE的碳青霉烯酶检测及同源性分析*

周文艳，张 华△，许永杰

1.遵义医科大学，贵州遵义 563000；2.贵州省人民医院检验科，贵州贵阳 550000

抗菌药物在治疗细菌感染方面发挥了巨大的作用，但随着抗菌药物的大量使用，细菌耐药问题也日渐严重[1]。耐药菌的出现给患者及家庭带来极大的经济负担，且威胁患者生命健康[2]。碳青霉烯类抗菌药物可与青霉素结合蛋白结合并阻止肽聚糖合成，导致细胞裂解死亡[3]。因该药具有抗菌谱广、毒性相对较低、不产生交叉耐药等特点，被认为是治疗多重耐药革兰阴性菌感染的首选药物[4]。因近年来碳青霉烯类抗菌药物使用增加，耐碳青霉烯类抗菌药物的细菌也随之增加，而耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌(CRE)的出现成为关注的焦点[5]。患者感染该菌后临床可用药物少，病死率高，尤其是在无菌体液中检出的CRE，绝大多数为侵袭性感染，治疗药物更有限，病死率更高[6]。因此，本研究主要分析贵州省人民医院(以下简称本院)2019年6月至2021年6月收集的无菌体液标本中CRE的耐药情况和同源性，旨在为本院院内感染防控和临床合理用药提供参考依据，预防及减少CRE的产生。

1 资料与方法

1.1一般资料 选择本院2019年6月至2021年6月门诊及住院患者送检的无菌体液标本中检出的111株CRE为研究对象，剔除同一患者相同标本类型的重复菌株。药敏试验质控菌株为大肠埃希菌 ATCC25922、铜绿假单胞菌ATCC27853，碳青霉烯抑制剂增强试验质控菌株为经测序携带blaKPC的肺炎克雷伯菌、携带blaNDM的大肠埃希菌，脉冲场凝胶电泳质控菌株为沙门菌H9812，所有质控菌株均为本实验室保存。

1.2CRE的判定 对亚胺培南、美罗培南、厄他培南其中任意一种碳青霉烯类药物耐药的肠杆菌科细菌。

1.3仪器与试剂 BD phoenix-100细菌鉴定药敏仪(美国BD公司)，VITEK-2全自动细菌鉴定药敏仪及配套试剂(法国梅里埃公司)；脉冲场凝胶电泳仪及配套设备(美国伯乐公司)，恒温水浴箱及恒温振荡器(常州奥华仪器有限公司)，脉冲场电泳小胶块清洗器(成都兰博易生物科技有限公司)。亚胺培南和美罗培南药敏试验纸片(上海赛默飞有限公司)；哥伦比亚血平板、MH平板(广州迪景科技有限公司)；Seakem gold琼脂糖(美国Lonza公司)，XbaⅠ内切酶(宝日医生物技术有限公司)，蛋白酶K(北京普洛麦格生物技术有限公司)，NG-Test CARBA 5碳青霉烯酶检测试剂盒(长沙复星诊断科技有限公司)。

1.4方法

1.4.1细菌鉴定及药敏 采用BD phoenix-100或VITEK-2全自动细菌鉴定药敏仪进行细菌鉴定及药敏试验，K-B法或E-test法对药敏结果进行复核，抗菌药物敏感性判定参考美国临床和实验室标准化协会2020年发布的药敏试验折点标准。

1.4.2表型和基因型检测 碳青霉烯酶表型检测和基因型检测分别采用文献[7]中推荐的碳青霉烯酶抑制剂增强试验和胶体金免疫层析法。

1.4.3同源性分析 应用脉冲场凝胶电泳(PFGE)对91株肺炎克雷伯菌株进行同源性分析，将细菌培养18～20 h，采用比浊仪将待测菌调为3.7～4.0麦氏浊度的菌液，加入蛋白酶K，1%Seakem Gold，混匀制备胶块；用细胞裂解液在56 ℃水浴摇床中裂解3 h；56 ℃的TE缓冲液重复清洗胶块10次；加入含XbaⅠ内切酶的酶切混合液，37 ℃水浴孵育2 h后进行脉冲场凝胶电泳；电泳结束后，使用GelRed核酸染料染色30 min，再脱色20 min，放入凝胶成像仪拍照。

1.5统计学处理 采用WHONET5.6软件统计CRE的耐药情况；采用SPSS21.0软件进行标本类型、菌株种类、科室分布等统计分析，计数资料采用百分数表示；应用BioNumerics软件对PFGE结果进行同源性分析。

2 结 果

2.1标本类型 CRE来源的无菌体液标本类型以血液标本[55.9%(62/111)]为主，其次为腹水[25.2%(28/111)]、胸腔积液[8.1%(9/111)]、脑脊液[3.6%(4/111)]、盆腔积液[1.8%(2/111)]、胆汁[0.9%(1/111)]、腹腔引流液[0.9%(1/111)]、髂窝引流液[0.9%(1/111)]，以及其他无菌体液[2.7%(3/111)]。

2.2菌株的种类 111株CRE菌株中，检出率位于前3位的分别是肺炎克雷伯菌[82.0%(91/111)]、大肠埃希菌[10.8%(12/111)]、产酸克雷伯菌[3.6%(4/111)]，其余检出的细菌有臭鼻克雷伯菌[1.8%(2/111)]、产气肠杆菌[0.9%(1/111)]、阴沟肠杆菌[0.9%(1/111)]。

2.3菌株的科室来源 CRE来源的科室分布中，肝胆外科分离出来的CRE最多，其次为重症监护病房(ICU)、血液内科、呼吸内科重症监护病房(RICU)、泌尿外科，见表1。

表1 菌株的科室来源

2.4药敏结果 CRE对大多数抗菌药物耐药，对β-内酰胺类抗菌药物耐药率较高，多高达100.0%；对头孢哌酮/舒巴坦、复方磺胺甲噁唑、氯霉素耐药率较低，分别为85.3%、80.0%、87.2%，见表2。

表2 CRE对抗菌药物的耐药率

2.5菌株的碳青霉烯酶表型和基因型分布 碳青霉烯酶抑制剂增强试验检测CRE的碳青霉烯酶表型，结果显示,肺炎克雷伯菌主要携带丝氨酸酶，大肠埃希菌主要携带金属酶。胶体金免疫层析试验检测CRE携带碳青霉烯酶类型，结果显示，108株(97.3%)携带碳青霉烯酶，其中94株(84.7%)携带KPC碳青霉烯酶，13株(11.7%)携带NDM碳青霉烯酶，1株携带IMP碳青霉烯酶，1株同时携带IMP和NDM碳青霉烯酶，未检测出OXA-48、VIM碳青霉烯酶；肺炎克雷伯菌主要携带KPC碳青霉烯酶[96.7%(88/91)]，大肠埃希菌主要携带NDM碳青霉烯酶[83.4%(10/12)]，见表3、表4。

表3 碳青霉烯酶抑制剂增强试验结果[n(%)]

表4 胶体金免疫层析试验

2.6菌株的同源性分析 将PFGE条带图谱进行分析，并将具有85%相似度的菌株判定为同一型，具体分型标准参照文献[8]：两菌株条带的大小数目完全相同表示是同一菌株；有1～3条条带不同表示属于不同亚型；4～6条条带不同表示可能相关，7条及以上条带不同表示不相关。结果发现，91株肺炎克雷伯菌可分为A～O 15个型，其中A型62株，除PICU、门诊、康复科未发现A型菌株外，其余科室均检出该种菌株，时间为2019年6月至2021年6月；B型有8株，主要集中在肝胆外科，ICU和肾内科各有1株，检出时间为2020年11月至2021年1月，见图1。其他型别菌株数量较少，呈散在分布。聚类分析图分析结果显示，肝胆外科病区分离出来的菌株主要有5型，A型25株(71.4%)，B型6株(17.1%)，C型1株(2.9%)，D型2株(5.7%)，G型1株(2.9%)。ICU分离出来的菌株有6型，其中A型14株(58.3%)，E型3株(14.3%)，B型、D型、K型、M型各1株。血液内科检出CRE有两种型别，其中A型6株，N型1株，其余各科室呈散在分布。

注：M为质控菌株沙门菌H9812；8470、8363、8409、8314、8246、8217、8313、8305、8285、8283、8273为本实验室细菌编号。图1 部分CRE的PFGE电泳图

3 讨 论

CRE是引起严重感染的重要病原体，如血流感染、肺部感染、复杂的腹腔感染等[9]。 据2020年中国细菌耐药监测网结果显示，2005-2018年，肠杆菌科细菌对碳青霉烯类药物的耐药率持续上升，尤其是肺炎克雷伯菌，对美罗培南的耐药率更是从2.9%上升至26.3%，近2年虽有所下降，但仍处于较高水平[10]，CRE治疗难度大，病死率高，严重威胁全球公共卫生安全[11]。CRE被定义为对任意一种碳青霉烯类药物耐药或者携带碳青霉烯酶的一类肠杆菌科细菌[12]。因实验条件限制，本研究2019年6月至2020年9月未做厄他培南药敏试验，因此CRE检出率可能比实际偏低。

本研究中CRE主要来源于血液标本，其次为腹水、胸腔积液等无菌体液标本，与杨玉琪等[13]结果相似。CRE的菌株类型主要为肺炎克雷伯菌，其次为大肠埃希菌，其余菌株较少，与郭普等[14]研究结果符合。患者年龄大、住院时间长、有基础疾病尤其是心脏及肺部疾病，以及长期使用广谱抗菌药物、接受过有创操作、使用过免疫抑制剂等都是感染CRE的危险因素[15-17]。本研究中的CRE主要来源于肝胆外科，可能与肝胆外科患者肝功能较差，以及肝移植患者服用免疫抑制剂，导致机体免疫力低有关。CRE检出较多的科室其次为ICU，可能与ICU患者病情普遍较重、住院时间长、广谱抗菌药物使用多、相对其他科室有创操作较多等因素有关。

本研究中CRE耐药情况严重，对头孢哌酮/舒巴坦、复方磺胺甲噁唑、氯霉素耐药率较低，临床医生可根据药敏结果合理用药。目前，治疗CRE的药物有限，最常用的有多黏菌素和替加环素，但它们有较大的毒性，并且可能使耐药性增加[18]。更严重的是，2018年我国报道了一种对碳青霉烯类抗菌药物、多黏菌素、替加环素都耐药的CRE菌株，这种菌株的出现，使CRE的感染无药可用，大大增加了CRE治疗的难度[19]。

CRE可以通过多种机制产生耐药，但最主要的机制是产碳青霉烯酶，尤其是在我国，约90%的CRE携带产碳青霉烯酶基因[20]。有研究表明，患者感染产碳青霉烯酶的CRE病死率高于感染其他类型的CRE[21]。因此，需要重点关注CRE菌株携带碳青霉烯酶情况。碳青霉烯酶按Ambler分类可分为 A、B 和 D 类3类，A类和D类为丝氨酸酶，B类为金属酶。其中A类丝氨酸酶KPC是世界范围内最流行的碳青霉烯酶[22]。NDM是流行程度仅次于KPC的碳青霉烯酶，于2009年在肺炎克雷伯菌中被分离出来[23]。我国检出最多的碳青霉烯酶为KPC，其次为NDM，部分地区有少量IMP、VIM、OXA-48等产碳青霉烯酶菌株的报道[23-24]。有研究证明，头孢他啶-阿维巴坦对产KPC和 OXA-48型丝氨酸酶的菌株有较高抗菌活性，但对产金属-β-内酰胺酶的菌株无抗菌活性[25]，而B类金属-β-内酰胺酶往往对氨曲南敏感，因此氨曲南/阿维巴坦复方制剂常用于由产金属酶的CRE引起的严重感染[26]。本研究中97.3%的CRE菌株携带碳青霉烯酶，高于ZHANG等[20]的研究结果，这可能与本研究中标本排除了痰液、尿液、粪便等非无菌体液标本有关，也可能与实验标本数量少有关；其余CRE菌株未检测到碳青霉烯酶，可能存在其他耐药机制，如合并其他β-内酰胺酶高表达(AmpC酶和ESBL酶)或者膜孔蛋白缺失等，需要后期进一步研究。

碳青霉烯酶抑制剂增强试验是一种简单易行的检测CRE产A类丝氨酸碳青霉烯酶和B类金属-β-内酰胺酶表型的方法。任艳丽等[27]将128株CRE碳青霉烯酶抑制剂增强试验的结果通过基因检测进行验证，结果完全符合。本研究结果显示，肺炎克雷伯菌主要携带丝氨酸酶，大肠埃希菌主要携带金属酶。胶体金免疫层析是一项可以快速、准确检测CRE携带碳青霉烯酶类型的技术，对临床感染CRE患者尤其是重症患者早期检测CRE产碳青霉烯酶类型并针对性用药十分重要[7]。有研究表明，相对于经典的PCR检测方法，免疫胶体金技术的灵敏度及特异度高达100%[28]。此外，本研究结果显示，97.3%的CRE菌株携带碳青霉烯酶，主要为KPC，其次为NDM，其中96.7%的肺炎克雷伯菌携带KPC，83.4%的大肠埃希菌携带NDM，与任艳丽等[27]研究结果相似。本研究中有2株CRE菌株表型试验为丝氨酸酶阳性但胶体金免疫层析法未检测到碳青霉烯酶，可能与胶体金免疫层析法只能检测KPC、NDM、IMP、VIM、OXA-48共5种常见碳青霉烯酶而无法检测其他罕见的碳青霉烯酶有关。表型检测和胶体免疫层析法结果不符合的需要后期进一步采用PCR扩增其他罕见基因来验证。

本研究中91株肺炎克雷伯菌可分共15个型。其中A型菌株数量最多，分布科室最广，表明A型菌株是院内最主要的流行菌株。B型菌株共8株，但检出时间仅在连续的3个月内，提示该菌株在该时间段引起过短暂流行。CRE检出率在肝胆外科、ICU、血液内科检出率较高，且A型占比较高，提示菌株间的亲缘性较高，可能存在克隆性传播，需要注意院感防控，加强隔离和环境消毒。少数不同科室不同患者检测出相似度为100%的同种菌株，提示科室之间可能存在交叉感染，需注意不同科室之间患者转科的管理等。

综上所述，CRE的播散较快，且目前可用药物少，治疗难度大。因此，应建立有效的检测体系，同时建立早期主动筛查机制，对耐药菌进行科学、专业化管理。同时应加强院感防控，强化医务人员院感防控意识，规范各项医疗操作。