氮硫磷氯共掺杂荧光碳点探针用于食品中 胭脂红的快速检测

钱敏捷，孙慧娟，何海林，赵盛燕，肖丽霞，杨振泉，胡钦

（扬州大学食品科学与工程学院，江苏扬州 225001）

食品着色剂作为一种常用的食品添加剂，通常用于改善食品的口感、香味和颜色[1]。胭脂红（CRM）作为一种人造色素，已在食品工业中被广泛作为着色剂使用[2]。CRM属于合成偶氮颜料，呈颗粒状或粉末状，颜色为红色至深红色。据报道，CRM具有致癌和致突变作用[3,4]，而且具有一定的遗传毒性潜力[5]。因此，许多国家严格规定了食品中CRM的最大使用限量。例如，CRM在中国和欧盟允许被使用，而在美国和日本则被禁止使用[2]；CODEX规定食品中添加CRM的限量为50.0～500.0 mg/kg[6]；我国允许在果汁、山楂制品、糖果、酱菜和饮料中添加CRM的限量不得超过50.0 mg/kg或50.0 mg/L[7]；欧盟规定在香肠、果酱等食品中使用CRM的限量为100.0～200.0 mg/kg[8]。尽管不同国家对食品中CRM的使用都规定了严格的限量标准，但是在食品加工中仍存在CRM添加过量的情况。因此，开发一种简单、快速、准确的CRM检测方法对于保障食品安全和人类健康至关重要。

目前，常用的CRM检测方法包括分光光度法[9]，毛细管电泳[10]，高效液相色谱（HPLC）[11]和伏安法[12]等。然而，这些方法大多数都具有局限性。例如，分光光度法仪器设备简单、操作简便、快速，但检测准确度不高；毛细管电泳法分离效果好，所需样品量少，但其检测结果的重现性差；HPLC法虽然可以实现食品中胭脂红的有效分离和检测，但是其仪器价格昂贵，操作复杂且耗时长。因此，需要开发一种简单、成本低、灵敏、准确的快速分析方法来检测食品中的CRM。

碳量子点，简称碳点（carbon nanodots，CDs）是一种尺寸小于10 nm，具有类球形结构的新型荧光碳纳米材料[13]。由于CDs具有优良的物理化学性质，例如良好的生物兼容性[14]、低毒性[15]、发射光谱可调谐和高的光稳定性[16]，其自2004年被发现以来，就迅速吸引了人们的广泛关注。目前，制备碳量子点的方法主要包括电弧放电[17]、水热合成[18]、热解法[19]、微波辅助加热[20]、中和加热[21]和超声处理[22]等。近期研究表明，通过选择合适的杂原子供体，向CDs中掺入适当的杂原子，制备掺杂化的CDs探针，是提升CDs探针选择性和灵敏度的有效手段[23]。迄今为止，已有大量工作表明，掺杂化的CDs在食品有害因子检测方面，包括柠檬黄[24]、谷胱甘肽[14]、单宁酸[25]、农药[26]等，展现出高选择性和高灵敏度的优势。

本工作以葡萄糖为碳源，乙二胺、磷酸、盐酸和硫酸为杂原子供体，借助酸碱中和自放热作用，制备出氮硫磷氯共掺杂碳点（N,S,P,Cl-CDs），并将其作为荧光探针用于食品中CRM的快速检测。本工作对实验条件进行了优化，研究了该方法的线性范围、灵敏度、选择性及抗干扰性，并探究了N,S,P,Cl-CDs和CRM之间的相互作用，进而提出CRM对N,S,P,Cl-CDs荧光猝灭的机理。最后，本检测方法被用于实际样品中CRM检测的可行性分析。

1 实验部分

1.1 实验试剂与仪器

本工作所有食品样品均采自江苏省扬州市本地市场；胭脂红和硫酸奎宁为分析纯，购自上海阿拉丁试剂有限公司；透析膜（截留分子量MWCO=500～1000 Da）购自美国Spectrum公司；其他药品和试剂均为分析纯，购自国药化学试剂有限公司；本实验室使用的超纯水来自Milli-Q-RO4超纯水净化系统，美国Millipore公司。

F-320荧光光谱仪，天津港东科技股份有限公司；HT 7800透射电子显微镜TEM，日本Hitachi公司；Cary 5000紫外-可见-近红外吸收光谱仪UV，美国Varian公司；Cary 610/670显微红外光谱仪IR，美国Varian公司。

1.2 N,S,P,Cl-CDs的制备

称取0.4 g葡萄糖置于50.0 mL玻璃烧杯中，依次加入6.0 mL乙二胺、2.0 mL浓H3PO4、2.0 mL浓HCl和2.0 mL H2SO4（质量浓度为70%）。在酸碱中和自放热作用下，反应混合物在数秒内变成泡沫状。获得的反应产物自然冷却至室温后，将反应产物转移至透析管（MWCO=500～1000 u）中，然后将其放入盛有1 L超纯水的烧杯中，透析3 d。在透析过程中，每隔24 h向烧杯中注入新的超纯水，并不断搅拌，最终得到棕色的N,S,P,Cl-CDs溶液。冷冻干燥后得到0.28 gN,S,P,Cl-CDs粉末，产率为70%。最后，将干燥后的N,S,P,Cl-CDs粉末置于干燥器中备用。

1.3 工作参数优化

影响荧光猝灭效率的关键实验条件，包括N,S,P,Cl-CDs溶液浓度、反应体系pH和反应时间。在不特殊说明的情况下，N,S,P,Cl-CDs溶液采用超纯水进行配制。设置激发波长（λex）和发射波长（λem）分别为380 nm和453 nm。

1.3.1 N,S,P,Cl-CDs溶液浓度优化

为优化N,S,P,Cl-CDs的浓度，使用超纯水制备不同浓度（0.01～1.0 mg/mL）的2.0 mLN,S,P,Cl-CDs溶液，记录加入10.0 μmol/L CRM前后N,S,P,Cl-CDs溶液荧光强度的变化（F0/F）。

1.3.2 反应体系pH优化

为优化pH，分别使用磷酸缓冲盐溶液（10 mmol/L，pH 2.0～11.0）和超纯水（pH 5.8）配制2.0 mL最优浓度的N,S,P,Cl-CDs溶液，记录添加10.0 μmol/L CRM前后N,S,P,Cl-CDs溶液荧光强度的变化（F0/F）。

1.3.3 反应时间优化

为优化反应时间，在最优浓度和最优pH条件下，配制2.0 mLN,S,P,Cl-CDs溶液，向其中加入10.0 μmol/L CRM，记录不同时间间隔反应体系荧光强度的变化（F0/F）。

1.4 线性范围测定

将不同浓度的CRM逐步添加到2.0 mLN,S,P,Cl-CDs溶液（0.03 mg/mL）中，使CRM在N,S,P,Cl-CDs溶液中的浓度在0.1～20.0 μmol/L范围内。在λex/λem=380/453 nm下记录含有不同浓度CRM的N,S,P,Cl-CDs溶液的荧光强度。绘制荧光猝灭效率F0/F与N,S,P,Cl-CDs溶液中CRM浓度的线性关系图，其中F0和F分别代表添加CRM前后N,S,P,Cl-CDs溶液的荧光强度。

1.5 选择性测试

在2.0 mLN,S,P,Cl-CDs溶液（0.03 mg/mL）中分别添加实际样品中可能存在的干扰物质，包括15种氨基酸（蛋氨酸，丝氨酸，精氨酸，苏氨酸，组氨酸，L-甲硫氨酸，DL-半胱氨酸，酪氨酸，甘氨酸，亮氨酸，谷氨酸，丙氨酸，色氨酸，天冬氨酸和苯丙氨酸）、3种小分子（GSH，葡萄糖和抗坏血酸）、10种阴离子（F-，Br-，I-，Cl-，NO3-，HCO3-，CO32-，SO42-，H2PO4-和HPO42-）和8种阳离子（Na+，Ag+，K+，NH4+，Mg2+，Zn2+，Fe2+和Ca2+），添加浓度均为0.1 mmol/L，在λex/λem=380/453 nm 下记录添加干扰物前后N,S,P,Cl-CDs溶液的荧光强度。

1.6 抗干扰性测试

首先，在2.0 mL 0.03 mg/mLN,S,P,Cl-CDs溶液中添加0.01 mmol/L CRM，然后分别添加实际样品中可能存在的上述干扰物质进行混合，添加浓度均为0.1 mmol/L。在λex/λem=380/453 nm下，记录添加干扰物前后N,S,P,Cl-CDs溶液的荧光强度。

1.7 实际样品分析

选取的含有CRM的食品样品，包括李干、蜜桃干、果丹皮、草莓果酱、西瓜霜、功能饮料，作为实际样品。对于固体样品，先将其研碎或剪碎，然后称取0.6 g固体样品，溶解于10.0 mL超纯水中，超声处理10 min。在10000 r/min下，离心5 min，收集上清液。对于液体样品，取适量样品，超声20 min，除去样品中的气泡，准确量取5.0 mL，用超纯水稀释至25.0 mL。将样品提取液通过醋酸纤维素膜过滤（0.22 μm，26 mm内径，天津津腾有限公司）后，取20.0 μL样品提取液，加入2.0 mL 0.03 mg/mLN,S,P,Cl-CDs溶液，在λex/λem=380/453 nm下，记录添加提取液前后N,S,P,Cl-CDs溶液的荧光强度。采用国标法[27]对上述样品中的CRM含量进行检测，以验证该方法的准确性。

1.8 数据处理

本工作的所有数据均采用Origin软件（v8.0）进行处理，特别指出，N,S,P,Cl-CDs的粒径分布是采用Nano Measurer软件（v1.2）进行处理。

2 结果与讨论

2.1 N,S,P,Cl-CDs的理化性质表征

利用TEM对N,S,P,Cl-CDs的形貌和尺寸分布进行表征，如图1a所示，制备的N,S,P,Cl-CDs颗粒分散性良好，具有类球形结构。图1a的插图是通过随机计数电镜图上100个颗粒的大小，得到的粒径分布直方图。N,S,P,Cl-CDs的粒径分布范围为0.25～5.0 nm，平均粒径为2.27 nm。

采用傅里叶红外光谱FT-IR对N,S,P,Cl-CDs的官能团进行了表征，如图1b所示，3500～3350 cm-1和3150～2760 cm-1处的宽吸收峰属于-NH和-OH伸缩振动，1670 cm-1处的强吸收峰来自C=O伸缩振动，表明N,S,P,Cl-CDs表面存在氨基和羧基，赋予了N,S,P,Cl-CDs良好的水溶性。1250 cm-1处的吸收峰归因于C-O伸缩振动。2300、1500、1180、995和827 cm-1处的强吸收峰，分别归因于S-H伸缩振动、N-H弯曲，C-N伸缩，P-O-C弯曲和C-Cl伸缩振动。以上结果表明，N、P、S和Cl杂原子被成功掺杂到CDs中。

通过紫外可见吸收光谱（UV-Vis）研究了N,S,P,Cl-CDs的紫外吸收性质。如图2a所示，N,S,P,Cl-CDs的UV-Vis光谱在紫外区域具有两个吸收峰，分别为290 nm和368 nm，前者是由于C=O键的n→π*跃迁，后者是由于N、P、S和Cl杂原子引起的表面激发态[28]。

采用荧光光谱研究了N,S,P,Cl-CDs的荧光性质。N,S,P,Cl-CDs的激发光谱，如图2a所示，N,S,P,Cl-CDs的激发峰位于380 nm。N,S,P,Cl-CDs的发射光谱，如图2a所示，N,S,P,Cl-CDs在380 nm处激发时的发射峰为453 nm。图2b为N,S,P,Cl-CDs在不同λex下的荧光光谱。当λex从300 nm增加到490 nm时，N,S,P,Cl-CDs的λem在453 nm到553 nm范围内变动，即N,S,P,Cl-CDs的λem表现出典型的λem依赖行为[29]。在紫外线照射下，N,S,P,Cl-CDs溶液呈现出强烈的蓝色荧光（图2b的插图）。如图2c所示，以硫酸奎宁为参考物质，测得N,S,P,Cl-CDs的量子产率为5.8%。

2.2 实验条件的优化

2.2.1 N,S,P,Cl-CDs浓度对检测CRM的影响

本实验研究了不同浓度的N,S,P,Cl-CDs对CRM检测的影响。如图3a所示，随着N,S,P,Cl-CDs浓度变化，F0/F也随之变化。当N,S,P,Cl-CDs浓度为0.03 mg/mL时，F0/F达到最高值。因此，选择0.03 mg/mL作为CRM检测的最佳N,S,P,Cl-CDs浓度。

2.2.2 pH对检测CRM的影响

本实验研究了不同pH值（pH=2.0～11.0）对CRM检测的影响。如图3b所示，F0/F在pH 2.0～11.0的酸碱度范围内无较大差别。为了简化后续的工作，选择pH 5.8（超纯水）作为检测CRM的最佳pH。

2.2.3 反应时间对检测CRM的影响

本实验在N,S,P,Cl-CDs浓度为0.03 mg/mL，pH为5.8的条件下，考察了反应时间对CRM检测的影响。由图3c所示，向N,S,P,Cl-CDs溶液（0.03 mg/mL）中加入CRM后，F0/F在1.0 min内迅速增加，随着时间的继续增加，F0/F并没有发生明显改变。因此，选择1.0 min作为检测CRM的最佳反应时间。

2.3 不同浓度CRM对N,S,P,Cl-CDs荧光的影响

在优化的实验条件下，探究了CRM对N,S,P,Cl-CDs荧光淬灭的可能性。图4a显示了在不同浓度CRM存在的条件下，N,S,P,Cl-CDs溶液荧光强度的变化。当CRM浓度逐步增加（0.0～105.0 μmol/L）时，N,S,P,Cl-CDs的荧光强度逐渐降低，表明CRM可以有效地猝灭N,S,P,Cl-CDs的荧光强度。由图4b可见，CRM的浓度在0.01～14.0 μmol/L范围内时，F0/F与CRM浓度呈线出良好的线性关系，符合Stern-Volmer方程。所提出荧光方法的检测限为9.38 nmol/L。将本工作与先前报道的基于CDs的荧光检测方法进行比较（表1），结果显示，本工作报道的基于N,S,P,Cl-CDs的检测方法，其灵敏度优于之前报道的基于CDs的荧光检测法，表明本检测方法具有高灵敏度。

表1 基于CDs的胭脂红检测方法的对比 Table 1 Comparison of CDs-based fluorescence methods for CRM detection

2.4 . N,S,P,Cl-CDs的选择性和抗干扰性

本工作探究了N,S,P,Cl-CDs对实际样品中可能存在的干扰物质（不同种类的氨基酸，阴离子，阳离子和一些其他小分子）的选择性。由图5a所示，当向2.0 mL 0.03 mg/mLN,S,P,Cl-CDs溶液中加入0.01 mmol/L的CRM及其他干扰性物质时，只有加入CRM会明显猝灭N,S,P,Cl-CDs的荧光，而其他可能存在的干扰物质对N,S,P,Cl-CDs荧光强度的影响几乎可以忽略，表明N,S,P,Cl-CDs对CRM检测具有高选择性。

同时，本工作研究了N,S,P,Cl-CDs对CRM检测的抗干扰性。向2.0 mL 0.03 mg/mLN,S,P,Cl-CDs溶液中加入0.01 mmol/L的CRM后，再加入0.1 mmol/L其它干扰物质，测得加入干扰物质前后N,S,P,Cl-CDs/CRM检测体系荧光强度的变化。如图5b所示，在向N,S,P,Cl-CDs/CRM混合体系中加入上述可能存在的干扰物质后，没有观察到荧光强度的明显变化，表明N,S,P,Cl-CDs具有较强的抗干扰性。

2.5 CRM对N,S,P,Cl-CDs荧光的猝灭机理研究

为研究N,S,P,Cl-CDs和CRM之间的相互作用，本工作获得了CRM的紫外可见吸收光谱及N,S,P,Cl-CDs的荧光激发光谱和发射光谱。如图6a所示，CRM的紫外可见吸收光谱在200～700 nm范围内有吸收特性；N,S,P,Cl-CDs的荧光激发和发射光谱显示，其在380 nm处有一个激发峰，在453 nm处有一个相应的发射峰。可见，CRM的紫外可见吸收光谱与N,S,P,Cl-CDs的荧光激发和发射光谱有明显的重叠，表明CRM与N,S,P,Cl-CDs之间的荧光猝灭是由内滤效应引起的。

通常，荧光猝灭还可以分为静态猝灭和动态猝灭[32,33]。为进一步探究CRM对N,S,P,Cl-CDs的荧光猝灭机制，本工作研究了CRM对N,S,P,Cl-CDs荧光寿命的影响。图6b为N,S,P,Cl-CDs和N,S,P,Cl-CDs/CRM的荧光寿命衰减曲线。通过对荧光衰减曲线进行一阶函数拟合，发现N,S,P,Cl-CDs和N,S,P,Cl-CDs/CRM的寿命分别为2.48和2.20 ns，表明CRM的引入并未导致N,S,P,Cl-CDs平均寿命发生较大改变。因此，CRM与N,S,P,Cl-CDs之间的反应属于静态相互作用。总的来说，CRM对N,S,P,Cl-CDs的荧光猝灭是内滤效应和静态猝灭协同作用的结果。

2.6 实际样品的检测

为了研究本检测方法用于实际样品检测的可行性，本工作将该方法用于各种食品样品中的CRM检测。如表2所示，李干、蜜桃干、果丹皮、草莓果酱、西瓜霜和功能饮料提取物中的CRM含量分别为0.04、0.04、0.05、0.05、0.17和0.01 μmol/L。加标回收率结果显示，该实际样品检测的加标回收率在97.7%～104.2%的范围内，相对标准偏差（RSDs）低于3.29%，表明该方法具有高准确性。将检测结果与HPLC法（国标法）的检测结果进行比对，发现两种方法获得的检测结果相近，进一步证明了该检测方法的准确性。

表2 食品样品中CRM的检测 Table 2 Detection of CRM in various food samples

3 结论

本工作建立了一种基于N,S,P,Cl-CDs的荧光检测方法用于CRM的快速检测。该方法获得的线性范围为0.01～14.0 μmol/L，检测限低至9.38 nmol/L。除了高灵敏度，该方法还具有制备简单、操作简便、成本低、选择性好、抗干扰性强以及检测速度快的优点。最后，本工作将该方法用于实际食品样品中CRM的检测，加标回收率在97.8%～101.5%之间，RSDs低于3.29%，结果令人满意，表明本工作制备的N,S,P,Cl-CDs探针在CRM检测方面具有良好的应用前景。