水杨酸/季鏻盐双改性壳聚糖抗菌 保鲜剂的制备及表征

阮湘梅，杨子明，李普旺*，张怡，周闯，何祖宇，刘运浩，宋书会，王超*

（1.福建农林大学食品科学学院，福建福州 350000）（2.中国热带农业科学院南亚热带作物研究所，广东湛江 524091）（3.闽台特色海洋食品加工及营养健康教育部工程研究中心，福建福州 350002）

随着经济的不断发展，人们对果蔬新鲜的需求也随之提高。果蔬保鲜技术的发展对果蔬在运输过程中和货架期中保持新鲜是至关重要的，如何保持果蔬采后的新鲜和防止果蔬腐败是该领域面对的难题。涂膜保鲜是在果蔬表面形成一种有阻隔性的膜，来调控果蔬的呼吸，隔离有害微生物，提高保鲜效果。涂膜保鲜是在果蔬表面形成一种有阻隔性的膜，来调控果蔬的呼吸，阻隔有害微生物，提高保鲜效果[1]。壳聚糖（CS）作为天然的碱性多糖，具有一定的成膜性、抗菌性能和良好的生物相容性，已被广泛应用在医药、食品、化工等领域[2,3]。壳聚糖是一种氨基多糖，这种分子结构为改性提供了先决条件。单纯的壳聚糖抗菌效果一般，而且壳聚糖是一种只能溶于无机酸和有机酸的多糖，这极大地限制了其应用。因此对壳聚糖进行改性对于改善水溶性和提高抗菌性以及对拓宽壳聚糖的应用具有重要意义。水杨酸（SA）是小分子酸，渗透性强，具有杀菌防腐的作用，常被当作食品保鲜剂和防腐剂使用。研究表明水杨酸具有可降低水果在贮藏期间的呼吸强度、增强保护酶活性、抑制乙烯合成，抑制真菌活性等特性[4,5]。研究表明在壳聚糖分子结构上引入酚羟基可以增加接枝产物的抗氧化活性。

季鏻盐（TPPB）作为新一代高效、广谱、低毒杀菌剂，其P元素与季铵盐的N元素属于同族元素，并且与季铵盐具有相似的分子结构和化学性质，但其耐热性更好，具有泡沫少、pH值适用范围广等优异性能[6,7]。有研究表明，季鏻盐因P元素的电负性比季铵盐的N元素大，所以，其对细菌或真菌的电子吸附能力更强，抑菌效果更好[8,9]。

传统果蔬保鲜技术多采用高成本的冷藏保鲜、塑料保鲜膜、毒性大且功能单一的化学试剂[10]。因此，本文针对上述的问题，以天然高分子壳聚糖为基体材料，通过脱水缩合和酰胺化法将水杨酸和季鏻盐对壳聚糖进行双重抗菌改性，制备具有高效抗菌效果的涂膜保鲜剂。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

壳聚糖（CS，脱乙酰度：≥95%，粘度100～200 mPa·s）、(3-羧丙基)三苯基溴化鏻（TPPB）、1-羟基苯并三唑-水合物（HOB t），均采购自上海麦克林生化科技有限公司；水杨酸，美国阿拉丁工业公司；乙酸，西陇科学股份有限公司；试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

Nicolet iS5型傅里叶变换红外光谱仪，日本岛津公司；Bruker 400M型核磁共振，德国布鲁克公司；恒温加热磁力搅拌器，杭州大力科教仪器有限公司；梅特勒TGA/DSC 3+型热重分析仪，瑞士梅特勒公司；Zetasizer Nano ZS90纳米粒度及Zeta电位分析仪，英国马尔文仪器有限公司；电热恒温培养箱，上海一恒科技有限公司；冷冻干燥机，德国Christ公司。

1.3 实验方法

1.3.1 水杨酸改性壳聚糖

将壳聚糖溶于1%乙酸溶液中，浓度为0.75%，搅拌至粘稠状，然后加入不同摩尔比的水杨酸，经55～60 ℃下搅拌1.5 h[11]，然后用截留分子量为3500的透析袋透析2～3 d，最后冷冻干燥得产品（SA-CS）。

1.3.2 季鏻盐改性壳聚糖

采用酰胺化法制备季鏻盐-壳聚糖聚合物[12]，将壳聚糖溶于1%乙酸溶液中，充分搅拌使之完全溶解，浓度为0.75%，加入引发剂HOBt反应0.5 h，再加入季鏻盐，在N2环境下进行，反应温度为80 ℃，反应时间为24 h，然后用截留分子量为3500的透析袋透析2～3 d，最后进行冷冻干燥即得所需样品（TPPB-CS）。

1.3.3 水杨酸/季鏻盐改性壳聚糖

采用酰胺化法制备水杨酸/季鏻盐-壳聚糖聚合物，首先将0.75 g壳聚糖溶于100 mL 1%乙酸溶液中，加入引发剂HOBt反应0.5 h后加入季鏻盐，在N2环境下进行，反应温度为80 ℃，反应时间22 h，然后加入0.45 g的水杨酸，继续反应0.5 h，之后用截留分子量为3500的透析袋透析2～3 d，最后进行冷冻干燥即得所需样品（SA-CS-TPPB）。

1.3.4 SA-CS-TPPB水溶性测定

称取0.01 g左右的干燥样品溶于10 mL水中，震荡溶解2 h后离心，所得沉淀经冷冻干燥后称重，计算溶解性。

1.3.5 SA-CS-TPPB取代度测定

采用酸碱滴定法测定取代度，通过测定氨基含量的变化来确定壳聚糖的修饰程度。首先取0.3 g左右的样品溶解于30 mL 0.1 mol/L的标准盐酸溶液中，加入2～3滴甲基橙-苯胺蓝指示剂，用0.1 mol/L的标准NaOH溶液滴定游离的HCl溶液。另取一份壳聚糖置于105 ℃烘干至恒重，测量壳聚糖的含水量。每个样品做三个平行。计算：

式中：

C1——标准盐酸浓度，mol/L；

V1——标准盐酸体积，L；

C2——标准氢氧化钠浓度，mol/L；

V2——标准氢氧化钠体积，L；

H——壳聚糖含水量，%。

式中：

T1——壳聚糖的氨基含量，%；

T0——样品的氨基含量，%。

1.3.6 结构表征

1.3.6.1 傅里叶红外光谱（FT-IR）

将样品与KBr研磨成粉压片，对产物进行红外光谱的定性表征，E＞10（V），扫描波数范围4000～400 cm-1。

1.3.6.2 核磁共振（1H-NMR）

将壳聚糖、水杨酸和季鏻盐/水杨酸壳聚糖接枝物分别溶于D2O中配成10 mg/mL的溶液，用核磁共振仪扫描得到1H-NMR谱图。

1.3.6.3 X射线衍射（XRD）

使用Cu-K辐射（40 kV，30 mA），扫描速度为5 /min℃ ，室温。衍射测量范围为1 °～90 °，角度分辨率为0.0001 °，时间为30 min，分析材料的晶体结构。

1.3.6.4 热重分析（TG）

TG-209热重分析仪，称取10 mg的试样，在氮气氛围下，将试样以10 ℃/min的升温速率升至600 ℃，得到热失重曲线。

1.3.6.5 机械性能测试

将样品制成宽×厚×长为10 mm×0.6 mm×30 mm的膜，经电子万能试验机测试，测试速度为10 mm/min，夹距为15 mm。

1.3.7 抗菌性测定

抑菌圈法：把样品制备成1 mg/mL的溶液，将灭好菌的6 mm滤纸片放入其中浸泡1 h，然后置于涂好菌悬液的平板上，在37 ℃培养24 h后，观察并测量在滤纸片周围会形成菌生长禁止圈（即抑菌圈）。抑菌圈的面积越大，抗菌效果越好，并用游标卡尺测量抑菌圈直径。

1.4 数据统计分析

使用OriginPro 8.5软件和MestReNova-3作图，数值以平均值±SD表示。当获得的p＜0.05时表示有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 水溶性

从图1可以看出，随着水杨酸比例的增加，聚合物水溶性呈现先上升后下降的趋势，在CS:SA为1:0.75时水溶性最高，达到84.4%，原因可能是壳聚糖接枝少量水杨酸可在一定程度上破坏壳聚糖原有的分子链规整度，使溶解性上升，而水杨酸是小分子物质，很容易接枝到壳聚糖上，若接枝过量水杨酸会使水杨酸的羟基与壳聚糖的氨基形成更稳定的分子内氢键，从而使壳聚糖聚合物溶解性下降。因此，选出的壳聚糖:水杨酸的最佳摩尔比为1:0.75。

从图2可以看出，随着季鏻盐量的增加，聚合物水溶性曲线逐渐增加，最后趋于水平，即在CS:TPPB为1:1的时候，聚合物达到了100%，完全溶解，经分析原因可能是加入的季鏻盐达到一定量后壳聚糖取代度不再提高，季鏻盐分子量比水杨酸较大，且不会和壳聚糖的氨基形成分子内氢键，因此不会像水杨酸接枝壳聚糖一样溶解性随着摩尔比的增加而下降，而是达到最大溶解度后不再变化。选出的壳聚糖:季鏻盐的最佳摩尔比为1:1。

由图3可知，在确定壳聚糖和水杨酸的摩尔比后，SA-CS-TPPB聚合物的溶解性和TPPB-CS的溶解性曲线一致，溶解性随着季鏻盐含量的增加而增大，在达到完全溶解前，在CS:TPPB:SA为1:0.3:0.75时溶解性为60.00%，大于TPPB-CS摩尔比为1:0.3的45.00%溶解性，但小于SA-CS摩尔比为1:0.75时的84.40%溶解性，CS:TPPB:SA为1:0.5:0.75溶解性为95.00%，大于TPPB-CS摩尔比为1:0.5的90.00%和SA-CS摩尔比为1:0.75的84.40%溶解性，在CS:TPPB:SA为1:1:0.75时聚合物溶解性已达到完全溶解。说明水杨酸和季鏻盐同时改性壳聚糖对壳聚糖溶解性的提高不是简单的叠加，而是相互作用后呈现一定的规律性，水杨酸和季鏻盐同时接枝改性壳聚糖效果比单个对壳聚糖的改性好；水杨酸和季鏻盐同时改性壳聚糖最佳摩尔比为CS:TPPB:SA为1:1:0.75。

2.2 取代度和Zeta电位

表1是对优化后的壳聚糖衍生物做了一个取代度及Zeta电位比较分析，Zeta电位从高到低分别为：SA-CS-TPPB＞SA-CS＞TPPB-CS。由表可知，聚合物取代度相对较高，Zeta电位也比较高，即对菌的吸附能力更强；SA-CS的取代度比TPPB-CS的取代度高，水杨酸用量比季鏻盐少，而取代度却更高，是因为水杨酸是小分子酸，分子量比季鏻盐小，更容易接枝到壳聚糖上。

表1 CS、SA-CS、TPPB-CS及SA-TPPB-CS的取代度及Zeta电位 Table 1 Substitution degree and Zeta potential of CS, SA-CS, TPPB-CS and SA-TPPB-CS

2.3 傅里叶红外光谱

由图4可知，四条曲线的吸收峰基本相同，在保留壳聚糖特征吸收峰的同时，也体现了季鏻盐和水杨酸的特征吸收峰。衍生物光谱上1720～1770 cm-1处没有观察到酯类的C=O双键的伸缩震动吸收峰，说明它们的反应主要在壳聚糖的氨基上，而非与壳聚糖的羟基发生副反应，以酯基键的形式接枝到壳聚糖上。

TPPB-CS谱图在1528 cm-1出现了苯环C=C的骨架峰，750 cm-1处出现了苯环的C-H振动吸收峰，说明季鏻盐成功改性壳聚糖。

SA-CS谱图中1570 cm-1和1484 cm-1出现了水杨酸苯环骨架的特征吸收峰1621 cm-1处出现N-H振动吸收峰，说明水杨酸成功接枝到壳聚糖上。

SA-CS-TPPB谱图均出现了季鏻盐和水杨酸的特征吸收峰，分别是1527 cm-1、747 cm-1和1621 cm-1、1486 cm-1、1456 cm-1，说明季鏻盐和水杨酸成功共同改性了壳聚糖。

2.4 核磁共振

图5为各样品的核磁共振氢谱图，2.7×10-6是CS的H-2特征峰，在3.2～3.5之间属于壳聚糖在H-3、H-4、H-5和H-6位置的氢吸收峰。对比CS的1H-NMR发现，在SA-CS、TPPB-CS和SA-CS-TPPB谱图均有壳聚糖的特征吸收峰；SA-CS在6.82×10-6～7.22×10-6处有明显的特征吸收峰a1出现，这是水杨酸上不同芳氢的吸收峰，说明水杨酸成功接枝到壳聚糖上；在TPPB-CS谱图在7.5×10-6～8×10-6之间出现了新的信号峰H-p*，这是在季鏻盐上的侧链基团苯环的特征吸收峰。表明壳聚糖的骨架上引入了季鏻基；而在SA-CS-TPPB谱图既有水杨酸的特征峰a1，也有季鏻盐的特征峰b，且吸收峰的位置由于季鏻盐的电子吸附作用发生了轻微位移，a2左移，b右移。通过核磁进一步说明水杨酸和季鏻盐都成功接枝到壳聚糖上。

2.5 X射线衍射

由图6可知，壳聚糖（CS）在2θ=20 °处出现强而窄的衍射峰，在2θ=11 °处出现弱而宽的衍射峰，分别对应于晶型II和晶型I。三个壳聚糖衍生物在2θ=20 °处的衍射峰强度显著降低，并且在2θ=11 °处的衍射峰几乎消失。这一结果表明，将水杨酸和季鏻盐接枝到壳聚糖上可以显著降低壳聚糖的结晶性，结晶性的减弱可能是因为接枝水杨酸和季鏻盐后的壳聚糖分子上-OH和-NH2间的氢键作用力减弱，从而其水溶性提高了[13,14]。从图中也可以看出来，SA-CS比TPPB-CS两个特征衍射峰要高一些，即SA-CS的结晶性比TPPB-CS要高，因此其溶解性低一些，印证了前面溶解性的相关分析。

2.6 热重分析

热重分析（TGA）和导数热重分析（DTG）曲线显示了壳聚糖及其衍生物的失重情况，在加热过程中壳聚糖及其衍生物都发生了失重反应，图7中，在所有样品中观察到的初始重量损失（低于150 ℃）是由于表面水分和内部水的损失。壳聚糖降解温度在250 ℃左右，最大降解速率值的温度为300 ℃，用水杨酸和季鏻盐改性后衍生物的降解温度均有所下降，最大降解速率温度分别为237.5 ℃、243 ℃和250 ℃，说明水杨酸和季鏻盐改性壳聚糖对热稳定性有显著影响，但并没有完全破坏材料原有的规整度。

2.7 机械性能测试分析

由图8中可知，改性后的壳聚糖衍生物成膜力学性能均有不同程度的提高，这是因为季鏻盐和水杨酸的引入在一定程度上破坏了壳聚糖分子的结晶性和规整性，影响分子空间结构的排列，使得分子间氢键作用力减小。壳聚糖衍生物力学性能的提高，有助于在果蔬涂膜保鲜形成良好的保鲜膜[15]。

2.8 抑菌效果

由图9可知，SA-CS、TPPB-CS和SA-CS-TPPB三种聚合物较壳聚糖相比均有很好的抑菌效果，对金黄色葡萄球菌的抑菌效果比大肠杆菌的抑菌效果要好，这可能是因为金黄色葡萄球菌表面所带的负电荷高于大肠杆菌，聚合物对金黄色葡萄球菌的吸附性更强[16]；且金黄色葡萄球菌是革兰氏阳性菌，大肠杆菌是革兰氏阴性菌，从细胞壁的结构来看，革兰氏阳性菌具有很厚的结构粗糙的肽聚糖细胞壁，小分子物质扩散可轻易在此扩散，而革兰氏阴性菌的细胞壁比革兰氏阳性菌的更为复杂，具有一层外膜可选择透过物质，像筛子一样，因此，聚合物对金黄色葡萄球菌抑菌性能更佳[17,18]。抑菌性从高到低为：SA-CS-TPPB＞ SA-CS＞TPPB-CS。SA-CS的抗菌性比TPPB-CS要好可能是因为水杨酸和季鏻盐的抗菌机理不一样，季鏻盐主要是通过电子吸附作用达到抑菌效果；水杨酸是有机小分子酸，有很强的渗透性，酚羟基能通过促使微生物的蛋白质变性，还可以通过诱导机制改变植物或微生物相关酶的活性实现抑菌[19]，而SA-CS和TPPB-CS都是带正电荷，对菌均有吸附作用，SA-CS在有吸附作用的基础上还有水杨酸的抗菌机理，因此其抑菌效果比季鏻盐的抑菌效果要好。

3 结论

本研究以天然高分子壳聚糖为基体材料，通过脱水缩合和酰胺化法将水杨酸和季鏻盐同时对壳聚糖改性，制备出水杨酸/季鏻盐壳聚糖衍生物，改性后的壳聚糖衍生物结晶性和热稳定性有所下降，有效提高了壳聚糖衍生物的水溶性、抗菌性和成膜力学性能，且季鏻盐和水杨酸同时改性的壳聚糖衍生物比单个改性的衍生物抑菌效果和机械性能要好，研究得出：

（1）壳聚糖和季鏻盐的最佳摩尔比为1:1；壳聚糖和水杨酸的最佳摩尔比为1:0.75；即两个同时改性的摩尔比为壳聚糖:季鏻盐:水杨酸为1:1:0.75。

（2）水杨酸改性壳聚糖可有效提高壳聚糖的抗菌性和溶解性，季鏻盐改性壳聚糖可很好的提高壳聚糖的溶解性和抗菌性，TPPB-CS比SA-CS的溶解性好，而SA-CS的抗菌性比TPPB-CS要好，将水杨酸和季鏻盐一起改性可将两者的抗菌优势互补，更好的提高壳聚糖的抗菌性。

综上，壳聚糖经水杨酸和季鏻盐改性可对壳聚糖的溶解性和抗菌性有协同增效作用，所得壳聚糖衍生物有很好的水溶性、抗菌性和机械性能，在果蔬涂膜保鲜方面拥有不错的应用前景。