伊班膦酸钠联合骨髓间充质干细胞干预治疗骨质疏松动物的骨组织生物力学性能研究

刘晓辉 秦璇 杜静 郝明 高志达 潘铄 胡亚宁 田智广

0 引言

目前骨质疏松症治疗中最常应用的抗骨吸收药物为伊班膦酸钠等双膦酸盐类药物，但由于其依从性、耐受性较差,加之不良反应的影响,会限制其从抗骨吸收治疗中的获益[1]。伊班膦酸钠联合其他药物治疗骨质疏松症是一种重要的治疗方法。学者们对骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells ，BMSCs)联合其他药物等干预治疗骨质疏松症进行了大量的研究[2-8]。Piao等[9]分别以阿仑膦酸钠、BMSCs干预治疗骨质疏松大鼠后对大鼠股骨的黏弹性力学特性进行研究，得出BMSCs具有恢复骨质疏松动物的代谢功能、骨量以及应力松弛、蠕变力学特性的结论。

越来越多的研究者希望通过干细胞联合其他药物达到提升骨骼的生物力学性能进而实现治疗骨质疏松症的目的。目前以伊班膦酸钠联合BMSCs干预治疗动物骨质疏松的生物力学机制尚不明确，骨质疏松症的表现形式主要是骨量丢失、好发骨折。骨折多由于骨骼的弯曲、压缩等力学性能降低所致。伊班膦酸钠对治疗骨质疏松具有一定的效果。对于以BMSCs联合伊班膦酸钠干预治疗骨质疏松后的压缩、弯曲强度等生物力学研究是临床关注的热点之一。目前以BMSCs、伊班膦酸钠干预治疗动物骨质疏松后，研究其压缩、弯曲力学性能的报道较少。为此本文拟采用动物实验的方法，对以伊班膦酸钠联合BMSCs干预治疗后的大鼠股骨进行弯曲、压缩力学性能实验，以骨的压缩、弯曲力学性能指标研判伊班膦酸钠联合BMSCs进行干预治疗骨质疏松后大鼠骨的力学机制恢复效果。

1 材料与方法

1.1 实验动分组

雌性5月龄SD大鼠60只，随机分为正常对照组12只，骨质疏松动物模型组12只，骨质疏松动物模型以伊班膦酸钠干预组12只，骨质疏松动物模型以骨髓间充质干细胞干预组12只，骨质疏松动物模型以伊班膦酸钠联合骨髓间充质干细胞干预组12只。

1.2 骨质疏松动物模型复制与药物干预

将大鼠放在动物手术床上，将2%的戊巴比妥钠注射液2 mL/kg 注射到大鼠尾静脉使大鼠麻醉，然后切开大鼠腹部，切除双侧卵巢。建模7 d后，对以伊班膦酸钠联合骨髓间充质干细胞干预组大鼠通过尾静脉一次性注射大鼠BMSCs 3 × 106个(美国Sciencell公司)；按陈朝祥等[10]的方法通过尾静脉注射伊班膦酸钠10 μg/kg,南京恒生制药有限公司)，之后每隔7 d注射1次,90 d后取材。

1.3 标本采集与大鼠骨试样几何尺寸测量

于术后90 d分别对每只大鼠剪尾采血25 mL,将采集的各组血样在空气中静置15 min后用济南欧莱博科学仪器有限公司TD-6M型低速离心机2000 r/min离心20 min，取血清放置在-20 ℃冰箱内。然后将大鼠麻醉以断头法处死,取双侧股骨待做压缩、弯曲实验，取双侧胫骨待做骨密度测试。大鼠骨试样存放24 h后，以上海永科光学仪器有限公司生产的15JE型测量显微镜测量各组骨标本的长度和直径。股骨试样长31.6～32.2 mm，直径2.71～2.73 mm。胫骨试样长31.1～32.0 mm，直径2.24～2.31 mm。

1.4 评估指标

1.4.1 生化指标

生化指标为血清骨特异性碱性磷酸酶( bone alkaline phosphotase，BALP)、抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase-5b ，TRACP-5b)。

分别取各组大鼠血清样本，以深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司生产的MR-96A酶标仪、上海酶联生物科技有限公司生产的ELISA试剂盒，采用酶联免疫吸附双抗体夹心法检测血清中 BALP、TRACP-5b含量。

1.4.2 胫骨骨密度(bone mineral density，BMD)

以明维思Mindways QCT骨密度测量系统(美国得克萨斯州奥斯汀)测定大鼠胫骨骨密度。

1.4.3 股骨弯曲、压缩性能

使用济南中路昌试验机制造有限公司WDS-20电子万能试验机进行测试。按文献[11-13]中的方法对试样预调处理后进行弯曲实验。分别将每组大鼠右侧股骨试样各12个置于试验机的弯曲实验支座上，支座跨距20 mm。试验机的弯曲实验压头接触股骨标本中间，以2 mm/min的速度对试样施加弯曲载荷，测试样本的弯曲最大应力、弯曲最大应变、弯曲弹性应力、弯曲弹性模量。按文献[13-15]中的方法对试样预调处理后进行压缩实验。取正常对照组和实验组大鼠左股骨各12个试样，将标本置于试验机压缩实验工作台上，以2 mm/min的速度对试样施加压缩载荷，直至试样破坏，测试样本的压缩最大应力、压缩最大应变、压缩弹性模量。

1.4.4 统计学方法

计量资料以Mean±SD表示，用SPSS16.0 软件包(SPSS,Chicago,IL,USA)进行数据分析。组间数据差异采用单因素方差分析法和Sceffe法，P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果及分析

2.1 BMD、BALP、TRACP-5b

各组大鼠的BMD、 BALP、TRACP-5bK检测结果见表1。

表1 各组大鼠的BMD、 BALP、TRACP-5bK(n=12)Table 1 BMD,BALP and TRACP-5b of rats in each group (n=12)

实验结果表明，模型组BMD、BALP值小于正常对照组、伊班膦酸钠干预组、BMSCs干预组、伊班膦酸钠联合BMSCs干预组。其TRACP -5b大于正常对照组、伊班膦酸钠干预组、BMSCs干预组、伊班膦酸钠联合BMSCs干预组，差异具有统计学意义(P<0.05)。伊班膦酸钠联合BMSCs干预组BMD、BALP大于模型组、伊班膦酸钠干预组、BMSCs干预组，其TRACP-5b值小于模型组、伊班膦酸钠干预组、BMSCs干预组，差异具有统计学意义(P<0.05)。说明以伊班膦酸钠联合BMSCs干预后，具有提高骨质疏松动物BMD、BALP值，降低TRACP -5b的作用，说明骨质疏松动物骨功能活性与骨吸收的恢复效果明显。

2.2 压缩性能

各组大鼠股骨压缩实验结果见表2。

表2 各组大鼠股骨压缩实验结果(n=12)Table 2 Results of femoral compression test of rats in each group (n=12)

实验结果表明，股骨在压缩载荷作用下，股骨破坏后破坏断口多数为斜断口，部分试样破坏断口为横断口。模型组最大应力、最大应变、弹性应力、弹性应变、弹性模量小于正常对照组、伊班膦酸钠干预组、BMSCs干预组、伊班膦酸钠联合BMSCs干预组，差异具有统计学意义(P<0.05)。伊班膦酸钠联合BMSCs干预组最大应力、最大应变、弹性应力、弹性应变、弹性模量大于模型组、伊班膦酸钠干预组、BMSCs干预组，差异具有统计学意义(P<0.05)。

2.3 弯曲性能

各组大鼠股骨三点弯曲实验结果见表3。

表3 各组大鼠股骨三点弯曲实验结果(n=12)Table 3 Results of three point bending test of femur of rats in each group (n=12)

实验结果表明，股骨在弯曲应力作用下，股骨破坏后受拉侧面多为横断口，受压侧面多为斜断口，部分试样破坏断口为螺旋断口。模型组最大应力、最大应变、弹性应力、弹性应变、弹性模量小于正常对照组、伊班膦酸钠干预组、BMSCs干预组、伊班膦酸钠联合BMSCs干预组，差异具有统计学意义(P<0.05)。伊班膦酸钠联合BMSCs干预组最大应力、最大应变、弹性应力、弹性应变、弹性模量大于模型组、伊班膦酸钠干预组、BMSCs干预组，差异具有统计学意义(P<0.05)。说明BMSCs干预后，具有提高骨质疏松动物股骨弯曲强度的作用。

3 讨论

决定骨的抗压缩、抗弯曲等强度的关键因素是骨密度与骨质量[14]。各组大鼠胫骨骨密度测量结果显示，骨质疏松模型大鼠通过伊班膦酸钠联合BMSCs干预、BMSCs干预、伊班膦酸钠干预后骨密度都有一定的恢复，以伊班膦酸钠联合BMSCs干预骨密度恢复的效果最好。

TRACP-5b是骨的功能活性与破骨细胞数量有效的标志物[15]。骨在吸收的过程中，TRACP-5b被破骨细胞大量地释放出来， 血清TRACP-5b含量间接体现破骨细胞活性与骨吸收状态。TRACP-5b测试结果表明，骨质疏松模型大鼠通过伊班膦酸钠联合BMSCs干预、BMSCs干预后大鼠血清TRACP-5b比之前降低，说明伊班膦酸钠联合BMSCs对恢复骨的功能活性与骨吸收效果明显。

BALP反映成骨细胞的功能，来源于成骨细胞， 是评价骨形成与骨转换的常用代谢指标[16]。BALP测试结果表明，伊班膦酸钠联合BMSCs有利于恢复成骨细胞的功能，有利于骨形成与骨转换。

骨生物力学性能是判定骨组织质量不可或缺的主要指标，骨的“ 量” 和“ 质”共同决着骨的强度，即抵抗骨折的能力[17]。骨弹性模量是反映骨韧性的力学参数，当骨弹性模量降低，骨的脆性增高，韧性降低，发生骨折的概率相应增大[18-19]。女性绝经后，卵巢功能衰退引起内源性雌激素分泌减少与骨细胞表面的雌激素受体数量下降，导致骨吸收-骨形成偶联失衡， 出现破骨细胞活性增强， 成骨细胞活性相对减弱，骨形成速度减慢，并出现骨小梁变薄与间隙增宽、骨体积减少、骨小梁连接破坏等病理现象[20]。分析认为，由于骨质疏松大鼠骨密度发生了改变，骨小梁的组织形态发生了改变，所以其弯曲、压缩力学性能发生了改变。骨质疏松动物模型通过伊班膦酸钠联合BMSCs干预治疗后改善了骨的结构，提高了骨的强度和韧性，说明伊班膦酸钠联合BMSCs具有恢复骨质疏松模型动物骨密度和骨的压缩、弯曲力学特性的作用。伊班膦酸钠联合BMSCs干预骨质疏松模型动物股骨骨密度，骨的压缩、弯曲力学特性恢复得最好，与所预期的结果相符。

本实验发现大鼠骨的力学性能和大鼠骨密度BMD、血清TRACP-5b 、BALP具有一定的关系，骨密度BMD、血清TRACP-5b 、BALP恢复得越好，骨的压缩、弯曲力学性能标恢复得越好。

李云龙等[21]以骨髓间充质干细胞干预治疗骨质疏松症大鼠后对大鼠股骨进行剪切、冲击生物力学等实验，结果表明，骨髓间充质干细胞干预组血清Ca、ALP骨密度，骨剪切和冲击力学性能指标大于模型组及雷洛昔芬干预组(P<0. 05)。得出了骨质疏松动物通过以骨髓间充质干细胞干预后，骨密度，血清 Ca、ALP，骨的强度和韧性可以得到一定恢复的结论。Uejima等[22]将同种异体的 BMSCs注射到去卵巢骨质疏松大鼠模型的股骨髓腔中，研究发现，BMSCs移植后，显著提高该区域的骨密度，增强了骨弯曲生物力学强度。他们仅以BMSCs或其他单一药物干预治疗骨质疏松动物，具有一定的局限性。Wang 等[23]将BMSCs与海藻酸钙凝胶混合后注射到骨质疏松大鼠股骨远端，56 d后组织学观察表明，BMSCs联合海藻酸钙凝胶干预组的骨小梁数明显增加，骨强度明显提高。本文支持Wang 等[21]BMSCs联合其他药物干预骨质疏松动物骨强度明显提高的结论。

4 结论

骨质疏松动物通过以伊班膦酸钠联合骨髓间充质干细胞干预后，胫骨BMD、血清BALP升高，TRACP-5b水平下降，骨的压缩、弯曲强度和韧性可以得到一定的恢复。