丹红通精方对精索静脉曲张模型大鼠生精功能的影响*

何超拔，王友炼，袁少英，耿立果，覃湛，金明昱，张兆磊，王伟光

广东省中医院珠海医院，广东 珠海 519015

精索静脉曲张(varicocele，VC)是指精索内蔓状静脉丛的异常扩张、伸长和迂曲。普通成人患病率约为15%[1]，其中20%～50%患者伴精液质量异常和睾丸组织学异常，并影响男性的生育能力。生精细胞的大量凋亡与VC不育症密切相关，其细胞凋亡的机制主要与线粒体自噬相关蛋白通道、促细胞凋亡相关蛋白通道[2-3]以及环境毒素增加而诱导支持细胞肿瘤坏死因子受体超家族因子6(tumor necrosis factor receptor superfamily member 6，Fas)配体蛋白水平上升有关[4]。VC属于中医学“筋瘤”范畴，治疗以活血化瘀为主，并根据具体情况辨证加减，如佐以清热祛湿、疏肝行气、滋补肝肾等[5]。对于肾虚血瘀型VC不育症患者，中药治疗的妊娠率可以达到与手术治疗相当的效果[6]。丹红通精方是广东省名中医袁少英教授基于肾虚血瘀理论制定的治疗VC不育症的经验方，具体药物组成：蒲黄 10 g，五灵脂10 g，水蛭3 g，丹参20 g，黄芪30 g，红景天15 g，桃仁10 g，红花6 g，穿破石10 g，牡蛎 30 g，川牛膝10 g，黄精10 g，枸杞子10 g，具有活血化瘀、补肾养阴之效。前期相关研究表明，丹红通精方可显著改善VC不育症患者的精液质量[7]。本研究旨在通过构建VC大鼠模型探索其治疗VC不育症的现代医学机制，为其在临床的广泛应用提供理论依据。

1 材料

1.1 实验动物8周龄SPF级SD雄性大鼠40只，体质量(290±15) g，购于广东省医学实验动物中心，动物许可证号：SCXK(粤) 2008-0002，动物质量合格证号：0094460。饲养于中山大学附属第五医院SPF级实验动物中心，使用许可证号为：SYXK(粤)2018-0188。自由饮水、进食，温度(24±2) ℃，湿度50%～70%，定期清洁消毒。

1.2 药物及试剂蒲黄、五灵脂、水蛭、丹参、黄芪、红景天、桃仁、红花、穿破石、牡蛎、川牛膝、黄精、枸杞子颗粒(国药集团江阴天江药业有限公司，批号：19060431、19061801、19050711、19120571、19050811、19121901、19121291、19060813、19060513、19060624、19080724、19031881、19080332)。大鼠卵泡刺激素(follicle stimulating hormone，FSH)、黄体生成素(luteinizing hormone，LH)、双氢睾酮(dihydrotestosterone，DHT)检测试剂盒及FAS抗体、Fas配体(fas ligand，FasL)抗体(广州市欣福联生物科技有限公司，货号：E-EL-R0391C、E-EL-R0026C、E-EL-0031C、A0233、A0234)；原位末端脱氧核苷酸转移酶标记技术(TdT-mediated-dUTP nick end labeling，TUNEL)试剂盒(美国Promega公司，批号：15595-026)；Bouin′s固定液(北京索莱宝科技有限公司，批号：G2300)。

1.3 仪器JY-9000型伟力数码彩色精子质量检测系统(北京伟力新世纪科技发展有限公司)；BX53型荧光正置显微镜(日本OLYMPUS)；Pannoramic 250 Flash 型高分辨数字病理切片扫描系统(匈牙利3DHISTECH公司)。

2 方法

2.1 动物分组、造模与给药采用随机数字表法将40只SD雄性大鼠分为假手术组、模型组及丹红通精方低剂量组、中剂量组、高剂量组，每组各8只。除假手术组外，其余组大鼠参照Turner肾静脉缩窄术建立VC病理模型[8]，具体操作如下：戊巴比妥钠麻醉大鼠后，固定于操作台，剃毛消毒，取腹正中切口，依次切开皮肤、肌肉、腹膜，找到左肾静脉，顺着肾静脉找到精索内静脉，于下腔静脉与精索内静脉之间放上24 G针头，将针头与左肾静脉一起结扎，观察发现左肾淤血明显，然后小心抽出针头。随即可见左肾静脉扩张和左肾淤血消失，此时左肾静脉结扎处的直径减半，表示手术成功。假手术组只打开腹腔并找到左肾静脉，不结扎。术后1周，各组大鼠开始灌胃，按照人与大鼠的体表面积进行换算[9]，丹红通精方低剂量组、中剂量组、高剂量组分别按1.3 g·kg-1·d-1、2.5 g·kg-1·d-1、5.0 g·kg-1·d-1标准给药，假手术组、模型组灌胃给予等体积生理盐水，早晚各1次，8周为1个疗程。

2.2 精液质量分析灌胃结束1周后再次麻醉SD大鼠，快速打开腹腔，剥离大鼠睾丸及附睾组织。取左侧附睾组织称其质量后置于水浴箱中预温的Hams′F10培养液中剪碎，37 ℃温育30 min，使用 JY-9000型伟力数码彩色精子质量检测系统检测精子活力及精子总数。

2.3 TUNEL检测睾丸细胞凋亡率取左侧睾丸，用冷生理盐水反复冲洗，电子天平称其质量，取部分睾丸组织用Bouin′s液固定，24 h后梯度乙醇脱水，二甲苯透明，浸蜡、包埋。切取4 μm厚睾丸组织石蜡切片，脱蜡、脱水、透明后，其余步骤按TUNEL试剂盒说明书进行操作，显微镜下组织切片中细胞核呈棕褐色或棕黄色的细胞为TUNEL阳性细胞，观察每张切片的5个视野，记录生精细胞数目及凋亡的生精细胞数目，并计算生精细胞凋亡率。

2.4 Western Blot 检测大鼠睾丸组织中Fas、FasL蛋白的表达水平取大鼠左侧睾丸组织，用冷生理盐水反复冲洗，组织剪剪碎组织，放入RIPA 组织裂解液中，在玻璃匀浆器中匀浆破碎细胞，操作在冰上进行，每次匀浆约1 min，间隔5 min 匀浆1 次，共5 次。4 ℃ 下放置过夜后12 000 r·min-1离心约 5 min，取上清液，分装保存。依据BCA 蛋白定量检测试剂盒的操作说明书检测样品蛋白浓度；将分离胶置于电泳槽内加入电泳液；取样品蛋白体积2倍的加样缓冲液，每孔60 μg上样；开始电泳，分离胶恒压100 V、浓缩胶恒压120 V，直到溴酚蓝跑至浓缩胶末端；剥离凝胶转至PVDF 膜上；将PVDF膜采用TBST漂洗5 min，之后采用5%脱脂牛奶摇床封闭1.5 h；TBST 洗膜10 min后，4 ℃孵育一抗(稀释比例为11 000)过夜；TBST洗膜3次，每次 10 min，室温孵育二抗(稀释比例为11 000)2 h；TBST 洗膜3次，每次10 min，在暗室内显影、定影。采用Quantity one软件分析相关蛋白表达水平。

2.5 ELISA检测血清性激素的水平取大鼠下腔静脉血，离心后取血清，严格按照ELISA试剂盒说明书的要求检测大鼠血清中FSH、LH和DHT的水平。

3 结果

3.1 各组VC大鼠附睾精液质量比较最终造模成功的SD大鼠共32只，假手术组、模型组及丹红通精方低剂量组各6只，丹红通精方中剂量组、高剂量组各7只。结果表明，与假手术组比较，模型组大鼠的精子总数和运动精子百分比明显降低，不运动精子百分比明显升高，差异具有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较，丹红通精方低剂量组、中剂量组、高剂量组大鼠的精子总数和运动精子百分比明显升高，差异具有统计学意义(P<0.05)；丹红通精方中剂量组、高剂量组大鼠不运动精子的百分比明显减少(P<0.01)。见表1。

表1 各组VC大鼠附睾精液质量比较

3.2 丹红通精方对大鼠睾丸组织细胞凋亡的影响假手术组大鼠睾丸组织生精小管排列整齐，边界完整清晰，生精上皮饱满，各级生精细胞层次清晰，管腔内精子浓度高，可见不同发育形态的精子，未见明显凋亡的精子细胞。模型组大鼠睾丸组织生精小管排列紊乱，边界萎缩、塌陷，生精上皮结构错乱，各级生精细胞层次不清，管腔内精子稀少。丹红通精方低剂量组大鼠睾丸组织可见部分结构完整的生精小管，形态不一，生精上皮萎缩，细胞稀疏，管腔塌陷，管腔内可见少量精子细胞。丹红通精方中剂量组大鼠睾丸组织生精小管排列整齐，边界完整清晰，生精上皮饱满，各级生精细胞层次清晰，管腔内可见不同发育时期精子及少量精子细胞凋亡。丹红通精方高剂量组大鼠睾丸组织生精小管排列整齐，边界完整清晰，各级生精细胞层次清晰，管腔内精子浓度高，可见大量凋亡的精子细胞。细胞凋亡率比较发现，与假手术组比较，模型组大鼠睾丸组织细胞凋亡率升高；与模型组比较，丹红通精方低剂量组、中剂量组、高剂量组大鼠睾丸组织细胞凋亡率降低；与丹红通精方中剂量组比较，丹红通精方低剂量组、高剂量组大鼠睾丸组织细胞凋亡率升高，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表2，图1。

表2 各组VC大鼠睾丸组织细胞凋亡率比较

注：A：假手术组；B：模型组；C：丹红通精方低剂量组；D：丹红通精方中剂量组；E：丹红通精方高剂量组图1 丹红通精方对大鼠睾丸组织细胞凋亡的影响(×400)

3.3 各组VC大鼠睾丸组织中Fas、FasL蛋白表达比较与假手术组比较，模型组大鼠睾丸组织中Fas、FasL蛋白的表达水平升高，差异均有统计学意义(P<0.01)；与模型组比较，丹红通精方低剂量组、中剂量组大鼠睾丸组织中Fas、FasL蛋白的表达水平显著降低，丹红通精方高剂量组大鼠睾丸组织中FasL蛋白的表达水平显著降低，差异均有统计学意义(P<0.01)，Fas蛋白的表达水平虽有降低，但差异无统计学意义(P>0.05)。见图2，表3。

图2 各组SD大鼠睾丸组织Fas、FasL蛋白表达Western Blot图

3.4 各组VC大鼠血清性激素水平比较与假手术组比较，模型组大鼠血清中LH、FSH水平升高，DHT水平降低，差异具有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较，丹红通精方高剂量组大鼠血清中LH水平升高，丹红通精方各给药组大鼠血清中FSH的水平降低，DHT的水平升高，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表4。

表3 各组VC大鼠睾丸组织Fas、FasL蛋白表达比较

表4 各组VC大鼠血清性激素水平比较

4 讨论

现代医家对VC不育症的病因病机论述不尽一致，如贾玉森教授认为补肾法应贯穿VC不育症整个治疗过程[10]；张耀圣教授认为清阳不升、浊阴不降为因，肾虚血瘀为果，主张健脾益气，升清降浊[11]；郑军状等[12]认为，VC应以肝肾立论，肝气郁结、经络瘀阻、肾精不足是本病的基本病机，基本治则为疏肝通络强精。尽管各家论述有所侧重，但始终离不开肾虚与血瘀两方面，即肾虚血瘀是VC不育症基本病机[13-14]。袁少英[15]认为瘀血内阻是VC的根本病因，瘀血日久，化热伤阴伤气，耗伤肾精肾气，故瘀热伤阴是VC不育症的主要病机。故VC不育症患者辨证当以化瘀为前提，并辅以补肾养阴生精之品，改善VC导致睾丸生精功能的损伤，调节性激素的水平[13，16]。丹红通精方是袁少英教授30余年实践经验的自创代表方，由蒲黄、五灵脂、水蛭、丹参、黄芪、红景天、桃仁、红花、穿破石、牡蛎、川牛膝、黄精、枸杞子组成，体现活血化瘀、养阴生精的学术思想。方中红景天益气补血活血，水蛭破血通经、逐瘀消癥，“力攻积久之滞”；蒲黄、五灵脂合用即失笑散，是化瘀止痛的要药，四药合用为君，共奏活血化瘀、通络止痛、补益气血之效，起到推陈出新、驱邪不伤正的效果。黄精、枸杞子共同组成二精丸，《本草经疏》曰：“枸杞子，润而滋补，兼能退热，而专于补肾、润肺、生津、益气，为肝肾真阴不足、劳乏内热补益之要药。”《本经逢原》曰：“黄精，宽中益气，使五藏调和，肌肉充盛，骨髓强坚，皆是补阴之功。”丹参可活血凉血、清瘀热；穿破石清热活血，诸药合用，可补肾填精，活血清热养阴，共为臣药。黄芪可大补脾肾之气，升举阳气，益气养血，为气中血药；桃仁、红花可活血止痛、化瘀通络；牡蛎性味咸，微寒，入肝肾经，可软坚散结，共为佐药，可活血化瘀、升举阳气；牛膝既能活血，又引药下行至病所，具有画龙点睛之笔为使药。前期的研究结果表明，丹红通精方能改善VC不育症患者精子浓度、精子总活力、精子前向运动率、精子低渗肿胀率、精子顶体酶，降低精浆缺氧诱导因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α)的水平，其作用机制可能与改善生殖系统缺氧状态有关[7]。但其是否可通过性激素或Fas/FasL通路改善精液参数尚未明确。

本次研究的结果显示，造模成功的VC大鼠精子总数及活力下降，DHT水平降低，FSH、LH反馈性升高；服用丹红通精方可显著提高VC不育模型大鼠的精子总数，改善精子活力，其中丹红通精方中剂量组、高剂量组大鼠的不动精子百分数降低，与已有的研究结果一致，表明丹红通精方可改善VC大鼠的精液参数。

精子的生长及分化受下丘脑-腺垂体-睾丸轴的内分泌水平调控。LH可促进睾丸间质细胞分泌雄激素，以刺激精子的发生。FSH促进支持细胞分泌雄激素结合球蛋白，与雄激素结合，保持生精小管内较高的活性雄激素水平，促进精子发生。而支持细胞分泌的抑制素和间质细胞分泌的雄激素可反馈性抑制下丘脑促性腺激素释放激素(gonadotropinreleasing hormone，GnRH)和腺垂体FSH、LH的分泌。支持细胞分泌的抑制素减少，导致FSH、LH反馈性升高。VC大鼠由于睾丸缺氧、局部高温及氧化应激等机制导致睾丸组织细胞不同程度凋亡[17]，从而导致生精功能障碍。研究表明，FSH、LH在促性腺激素抑制模型中可独立维持精子的发生[18]，给予不同剂量的丹红通精方后，睾丸间质细胞分泌的雄激素增多，对下丘脑GnRH的负反馈作用减弱，VC不育大鼠血清中DHT水平升高，反馈性降低FSH水平，提高LH水平。即丹红通精方可通过负反馈抑制作用增加LH的分泌，减少FSH的分泌；还可促进间质细胞分泌DHT，促进精子的发育和成熟，二者共同作用改善精子浓度及活力。

Fas、FasL是两种重要的调控细胞凋亡的蛋白质，在人体的子宫、睾丸、甲状腺、脑等器官广泛表达，对生殖系统具有重要的作用。Lee等[19]证明了大鼠的睾丸遭受理化损伤后(如辐射暴露或给药)，Fas会在睾丸中大量表达。Francavild S等[20]发现，在生殖细胞停滞患者中 Fas表达上升，表明某些不育患者中Fas过量表达可能导致精子质量低下。也有研究表明，Fas在成熟精子的表达可作为细胞凋亡的生物标志物[21]。张培海等[22]认为大多补肾活血类中药可以抑制FasL的过度表达，减少生精细胞的凋亡进而改善精液质量。对于Fas系统具体的调节机制，有研究者认为[23-25]，睾丸细胞凋亡主要涉及FasL依赖性，内源性和外源性凋亡途径的直接或间接调节。一方面，FasL诱导信号复合体(death-inducing signaling complex，DISC)激活半胱氨酸蛋白酶(caspase)-8，然后激活caspase-3、caspase-6、caspase-7级联反应，导致细胞凋亡；另一方面，caspase-8的激活有助于调控线粒体通路作用于B 细胞淋巴瘤-2(B cell leukemia，Bcl-2) /Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 associated X protein，Bax)，上调caspase-9、caspase-3诱导凋亡。本次研究中，与假手术组比较，模型组大鼠的睾丸组织破坏严重，显微镜下可见生精小管塌陷、排列紊乱，各级生精细胞层次不清，管腔内精子稀少。TUNEL及Western Blot的结果表明，与模型组比较，服用不同剂量的丹红通精方后，大鼠的睾丸组织凋亡率明显下降，凋亡相关因子Fas、FasL蛋白的表达降低，表明丹红通精方可以通过下调Fas、FasL蛋白的表达水平，降低VC大鼠睾丸细胞的凋亡率，改善大鼠的生精功能。

综上，丹红通精方可明显改善VC大鼠睾丸的生精功能及精液质量，其作用机制可能与调控性激素LH、FSH、DHT及凋亡相关蛋白Fas、FasL的表达水平有关。