肝癌组织TPX2、TUFT1、Vimentin表达与癌细胞恶性生物学行为的关系及预测远处转移的价值研究*

流行病学调查显示，肝癌发病率居全球恶性肿瘤的第4位，病死率居第3位，而中国每年死于原发性肝癌约为11～13万人，超过全球肝癌死亡人数的50.0%

。外科手术、放化疗等综合治疗手段是现阶段临床治疗肝癌的主要方法，但癌细胞远处转移仍是患者死亡的主要原因

。因此，积极探索肝癌发生发展及预测肝癌远处转移的新标志物是目前临床研究热点问题。相关研究认为

，癌细胞远处转移与B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)、survivin、Bax、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(caspase-3)等细胞凋亡因子有关。同时，爪蟾驱动蛋白样蛋白2靶蛋白(TPX2)作为一种核增殖微管相关蛋白，在乳腺癌中出现过度高表达

，其在肝癌进程中的作用及潜在分子机制尚未完全明确。釉丛蛋白1(TUFT1)在细胞外釉质生长、成熟中发挥重要作用

，而其在肝癌远处转移中的作用机制鲜有研究。波形蛋白(Vimentin)是中间纤维主要组成部分，也是一种信号分子与转录因子，已被证实参与癌症发生、远处转移过程

，但关于其与癌细胞恶性生物学行为的关系及联合TPX2、TUFT1对肝癌远处转移的预测效能报道较少。因此，本研究首次探讨肝癌组织TPX2、TUFT1、Vimentin表达与癌细胞恶性生物学行为的关系及预测远处转移的价值。报道如下。

1 资料和方法

1.1 一般资料 选取2018年1月至2020年4月我院收治的51例肝癌远处转移患者为观察组(TxNxM1)及同时期51例肝癌无远处转移患者为对照组(TxNxM0)。对纳入患者的年龄、性别、体质量指数、饮酒史、吸烟史、合并疾病、肿瘤T、N分期、分化程度等进行信息采集。

1.2 纳入及排除标准 纳入标准：①两组患者均符合《原发性肝癌诊疗规范(2017年版)》

中肝癌诊断标准，并经手术组织病理诊断学确诊；②两组患者临床资料完整，卡氏功能状态量表评分≥70分；③对本研究知情同意。排除标准：①继发性肝癌或伴有其他部位肿瘤者；②肝外淋巴结转移者；③严重心脑肺肾功能不全者；④预计总生存期<3个月者；⑤凝血机制紊乱或活动性出血者；⑥严重认知功能障碍或精神行为异常者。

本研究经我院医学伦理委员会批准，所有研究对象均签署知情同意书。

1.3 观察指标 ①比较两组患者一般资料、TPX2 mRNA、TUFT1蛋白、Vimentin蛋白表达情况。②分析TPX2 mRNA、TUFT1蛋白、Vimentin蛋白之间的相关性。③比较两组癌细胞恶性生物学行为指标，即Bcl-2 mRNA、survivin mRNA、Bax mRNA、caspase-3 mRNA。④分析TPX2 mRNA、TUFT1蛋白、Vimentin蛋白与癌细胞恶性生物学行为指标(Bcl-2 mRNA、survivin mRNA、Bax mRNA、caspase-3 mRNA)的关系。⑤分析TPX2 mRNA、TUFT1蛋白、Vimentin蛋白与病理特征的关系。⑥分析TPX2 mRNA、TUFT1蛋白、Vimentin蛋白对肝癌远处转移的预测效能。

根据中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T2329-2009对上述防晒剂进行鸡胚绒毛尿囊膜试验，结果见表2。

（三）病理变化 对死亡羊只进行剖检，该羊消瘦、眼结膜苍白，显贫血症状，唇内及外阴口各有两个丘疹；心肝未见明显病变。肺微红、无弹性，有一处淤血，两侧肾上有大量坏死灶，前胃及四胃上有少许硬实的结节单个存在；肠系膜淋巴结微肿、发白，其余未见明显示病症状。

2.5 TPX2 mRNA、TUFT1蛋白、Vimentin蛋白与病理特征的相关性 TPX2 mRNA、TUFT1蛋白、Vimentin蛋白与肿瘤T、N分期呈正相关，与分化程度呈负相关(

<0.05)。见表5。

2 结果

2.1 两组患者一般资料比较 见表2。两组患者年龄49～78岁，组间年龄、性别、体质量指数、饮酒史、吸烟史、合并疾病比较，差异无统计学意义(

>0.05)。观察组患者与对照组肿瘤T、N分期、分化程度比较，差异具有统计学意义(

<0.05)。

为确保整个系统的可靠运行，MES系统采用控制和信息分流的设计理念，负责整个工艺设备运行和逻辑控制的PLC仅作控制使用，而RFID设备则采用独立的PLC来进行标签数据的读取和写入，与此同时，该项目中采用PROFINET总线网络，将各个读取站点的RFID设备进行组网，并与PLC进行组态通讯，由MES服务器通过PLC获取相关信息。

鉴于中国乡村特殊的历史背景和社会结构，以及价值观念被基层腐败和黑恶势力腐蚀的现实，乡村道德体系的修复、完善，在倡导初级阶段社会主义主流价值观的同时，应重点强调以下几点。

青花纹样是我国陶瓷器具中最为著名的纹样之一，江西四特集团则将这一纹样应用到其酒类器具的外包装之上，通过与酒容器的有效结合，这样的形式在消费者中受到了极大程度的欢迎，该集团的产品在市场上也取得了非常好的销售效果。另一方面，由于青花瓷纹样在世界范围内非常著名，因此，四特集团的酒类产品在东南亚、澳大利亚等地也同样取得了非常好的销售成果。与之类似的，衡水老白干52度十年陈酿使用了元青花中的卷草纹作为装饰图案，卷草纹自身所具备的清新淡雅的特点很好的表现出了这种酒自身的特点，进而在市场上得到了消费者的认可。

2.4 TPX2 mRNA、TUFT1、Vimentin与癌细胞恶性生物学行为指标的相关性 TPX2 mRNA与Bcl-2 mRNA(

=0.674，

<0.001)、survivin mRNA(

=0.656，

<0.001)呈正相关，与Bax mRNA(

=-0.688，

<0.001)、caspase-3 mRNA(

=-0.789，

<0.001)呈负相关；TUFT1与Bcl-2 mRNA(

=0.531，

<0.001)、survivin mRNA(

=0.699，

<0.001)呈正相关，与Bax mRNA(

=-0.627，

<0.001)、caspase-3 mRNA(

=-0.742，

<0.001)呈负相关；Vimentin与Bcl-2 mRNA(

=0.597，

<0.001)、survivin mRNA(

=0.692，

<0.001)呈正相关，与Bax mRNA(

=-0.615，

<0.001)、caspase-3 mRNA(

=-0.676，

<0.001)呈负相关。

1.4 检测方法 ①仪器与试剂盒：Trizol试剂、逆转录试剂盒均购自上海海方生物技术有限公司；兔抗人单克隆抗体TUFTI、Vimentin、过碘酸-雪夫(PAS)染色液均购自北京普利莱基因技术有限公司；枸橼酸钠、二氨基联苯胺(DAB)、苏木精、免疫组织化学试剂盒均购自上海同田生物技术股份有限公司。②TPX2 mRNA、癌细胞恶性生物学行为指标：取手术切除的距肿瘤边缘1 cm以内且无坏死的肿瘤组织作为标本，采用实时荧光定量PCR对肝癌组织TPX2 mRNA、Bcl-2 mRNA、survivin mRNA、Bax mRNA、caspase-3 mRNA进行检测，TPX2、Bcl-2、survivin、Bax、caspase-3引物见表1。PCR反应条件：95℃预变性30 s、95℃变性5 s、60℃退火延伸64 s，共40个循环。扩增结束后制作熔解曲线。2

法计算TPX2 mRNA、Bcl-2 mRNA、survivin mRNA、Bax mRNA、caspase-3 mRNA的相对表达量。③TUFT1和Vimentin蛋白表达：取手术切除的距肿瘤边缘1 cm以内且无坏死的肿瘤组织作为标本，采用免疫组织化学检测肝癌组织TUFT1和Vimentin蛋白表达，严格按照试剂盒说明书进行操作。TUFT1抗体、Vimentin抗体均以1∶50稀释，4℃过夜，加入磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤后，添加第二抗体，DAB显色，苏木精复染，中性树脂封固。结果判定：TUFT1、Vimentin阳性染色主要表现为细胞质与细胞膜显示棕黄色信号。同一切片根据染色强度分级分为无染色计0分，轻度染色计1分，中度染色计2分，强染色计3分；根据细胞染色比率为0计0分，1%～25%计1分，26%～50%计2分，51%～75%计3分，76%～100%计4分。阳性结果判定标准：二者相加≥4分者为阳性。

2.3 两组患者癌细胞恶性生物学行为指标 观察组患者Bcl-2 mRNA、survivin mRNA高于对照组，Bax mRNA、caspase-3 mRNA低于对照组(

<0.05)。见表4。

2.2 两组患者肝癌组织TPX2 mRNA、TUFT1和Vimentin蛋白表达及相关性分析 观察组TPX2 mRNA、TUFT1和Vimentin蛋白表达高于对照组(

<0.05)。见表3，图1、2。相关性分析显示TPX2 mRNA与TUFT1蛋白(

=0.800，

<0.001)、Vimentin蛋白(

=0.873，

<0.001)呈正相关，TUFT1蛋白与Vimentin蛋白呈正相关(

=0.676，

<0.001)。

2.6 TPX2 mRNA、TUFT1蛋白、Vimentin蛋白预测远处转移的ROC曲线 单一指标中，TPX2 mRNA、TUFT1蛋白、Vimentin蛋白预测远处转移的AUC分别为0.762(0.667～0.857)、0.835(0.758～0.912)、0.840(0.763～0.916)；各指标联合预测远处转移的AUC为0.932(0.885～0.978)，大于单一预测，见图3。

3 讨论

近期多项研究证实，癌细胞发生上皮间质化是诱导恶性肿瘤发生转移的重要因素

。黄丹红等

研究已证实，TPX2通过PI3K/Akt信号通路调控肝癌细胞增殖及凋亡，有望成为肝癌治疗的潜在靶点。但关于肝癌组织TPX2在肝癌远处转移中的作用尚需研究进一步论证。本研究采用实时荧光定量PCR法检测表明，肝癌远处转移患者TPX2 mRNA过度上调，结合白国民等

研究考虑这可能是由于TPX2上调，可刺激细胞中基质金属蛋白酶表达，进而促进肿瘤细胞侵袭及迁移。推测阻断TPX2表达可能是肝癌远处转移治疗的潜在靶点。另有文献称

，TPX2作为一种癌基因参与上皮细胞癌变的过程，并对癌细胞增殖、分化及生物学行为产生一定影响。本研究显示，随肝癌远处转移患者Bax mRNA、caspase-3 mRNA下降、Bcl-2 mRNA、survivin mRNA升高，TPX2 mRNA表达明显上升，可能与TPX2通过刺激Caspase级联反应诱导肿瘤细胞凋亡有关

。

Vimentin是一种在间质中表达的Ⅲ型中间丝蛋白，在上皮来源的恶性肿瘤组织或癌细胞株中过度表达

。本研究经免疫组织化学法检测可知，Vimentin在肝癌远处转移患者中呈异常高表达状态，并与肿瘤T、N分期、分化程度存在一定关系，考虑可能与Vimentin在癌细胞EMT过程中发挥关键调控作用有关，一定程度可增强癌细胞运动能力，提高癌细胞侵袭能力，诱导癌细胞向恶性程度更高的细胞表型转化，进而导致肿瘤局部复发与转移

。同时，细胞凋亡是一个由原癌基因、抑癌基因等多基因共同调控的复杂过程

。其中凋亡基因Bcl-2、Bax比值对细胞凋亡信号启动具有调控作用，其比值失衡会增强癌基因活性

；survivin为凋亡抑制因子，具有促进癌细胞分裂与抑制细胞凋亡的双重作用

；caspase-3活化是细胞凋亡途径的重要信号分子

。通过Spearman相关性分析发现，Vimentin与Bcl-2 mRNA、survivin mRNA均存在正相关性，与Bax mRNA、caspase-3 mRNA均存在负相关性，这可能归因于Vimentin一方面通过与p53蛋白形成复合体，有效阻断p53蛋白抗细胞凋亡作用；另一方面通过结合14-3-3调节蛋白，调控信号分子活性，抑制caspase-3、Bax等凋亡抑制因子表达增多，拮抗细胞凋亡

。

TUFTl在癌组织中呈高表达，可能与淋巴结转移及肿瘤分期有关，参与间充质干细胞的某些功能，影响上皮-间质转化相关蛋白表达

。本研究结果表明，随肝癌患者肿瘤T、N分期增加、分化程度降低、远处转移，TUFTl表达出现过度上调，结合李珍杰等

观点认为其机制可能与TUFT1通过与Rab蛋白GTP酶激活蛋白1相互作用，异常增殖癌细胞，并通过调控雷帕霉素靶蛋白复合物1信号通路，加快恶性肿瘤生长与转移存在相关性。同时，Dou C等

研究还显示，TUFT1不仅在多种恶性肿瘤组织中具有差异性表达，还参与恶性肿瘤生物学行为，支持本研究观点，TUFT1高表达可上调HIF1、Snail、Vimentin等蛋白表达，调控癌细胞EMT过程，并通过磷酸化蛋白激酶B(Akt)-磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白和Akt-磷酸化糖原合成酶3p信号传导，影响肝癌细胞凋亡

。本研究还发现，TPX2 mRNA、TUFT1蛋白、Vimentin蛋白之间存在正相关性，提示TPX2 mRNA、TUFT1蛋白、Vimentin蛋白可能通过调控EMT表达，在肝癌发生发展及远处转移中发挥协同作用。最后，本研究选取联合预测模型，发现TPX2、TUFT1、Vimentin联合预测肝癌远处转移AUC大于上述指标单一预测。有力佐证了早期联合检测TPX2、TUFT1、Vimentin，有望为临床预测肝癌远处转移、实施个性化治疗手段提供有效辅助手段。

综上可知，肝癌组织TPX2、TUFT1、Vimentin表达与癌细胞恶性生物学行为存在一定相关性，早期采用三者联合检测方式，有望成为临床预测肝癌远处转移、制定恰当治疗方案的新途径。

[1] Bray F,Ferlay J,Soerjomataram I,

.Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries[J].CA Cancer J Clin,2018,68(6):394-424.

[2] Liu Z,Jiang Y,Yuan H,

.The trends in incidence of primary liver cancer caused by specific etiologies: Results from the global burden of disease study 2016 and implications for liver cancer prevention[J].J Hepatol,2019,70(4):674-683.

[3] 赵和平,于燕.sB7-H3、IL-17和IL-8对原发性肝癌的诊断效果[J].中国现代医学杂志,2018,28(7):66-69.

[4] 胡凌波,周仁杰.原发性肝癌患者血清miR-6861-5p水平及临床意义[J].中国老年学杂志,2019,39(20):4968-4971.

[5] 许彦劼,夏明.曲马多对肺腺癌A549细胞增殖与凋亡和细胞周期的影响[J].医学研究生学报,2018,31(9):927-930.

[6] 吴池华,李一,杨麟翰,等.TPX2基因调控p38MAPK信号通路抑制乳腺癌细胞增殖及促进凋亡的机制研究[J].实用预防医学,2017,24(8):941-945.

[7] 王芳,崔金全,张海玲,等.TUFT1在卵巢上皮性癌组织中的表达及对卵巢上皮性癌SKOV3细胞生物学功能的影响[J].中华妇产科杂志,2020,55(2):125-129.

[8] 李国炜,李海洋,成超,等.波形蛋白在不同肝癌细胞系中的表达及其对肝癌增殖,侵袭及迁移的影响[J].重庆医学,2019,48(17):2913-2917,2922.

[9] 中华人民共和国卫生和计划生育委员会医政医管局.原发性肝癌诊疗规范(2017年版)[J].中华消化外科杂志,2017,16(7):635-647.

[10] 姚蓉蓉,王咪咪,王艳红.肿瘤相关巨噬细胞对Hep3B肝癌细胞上皮间质转化的促进作用及其机制[J].中华肝脏病杂志,2018,26(4):305-309.

[11] 黄丹红,吴建兵,简捷,等.TPX2通过PI3K/Akt信号通路调控肝癌细胞增殖及凋亡[J].肿瘤,2019,39(11):897-907.

[12] 白国民,李春耕,陆庆革,等.TPX2通过p38 MAPK信号通路诱导直肠癌HR-8348细胞凋亡[J].中国病理生理杂志,2019,35(1):48-54.

[13] 沈亮,许一鸣,丁胜光,等.TPX2在食管胃交界部腺癌中的表达及其与侵袭转移的相关性[J].中华临床医师杂志(电子版),2016,10(11):1505-1510.

[14] 杨忠信,黄志昂,潘丽红,等.TPX2对人肺癌细胞增殖、凋亡及cleaved caspase-3表达的影响[J].中华解剖与临床杂志,2018,23(2):155-159.

[15] Richardson AM,Havel LS,Koyen AE,

.Vimentin is required for lung adenocarcinoma metastasis via heterotypic tumor cell-cancer-associated fibroblast interactions during collective invasion[J].Clin Cancer Res,2018,24(2):420-432.

[16] 蓝春勇,凌冰,郭文文,等.VETC(+)肝癌内皮细胞中波形蛋白的表达及其与超声造影表现的关系[J].中华肿瘤杂志,2018,40(2):105-109.

[17] 鲁斌,程敏,周凡.Bad联合Caspase-8促凋亡基因共表达对SK-HEP-1肝癌细胞体外增殖、凋亡、迁移和体内成瘤影响的实验研究[J].实用医学杂志,2020,36(8):1030-1034.

[18] 金红,杨岚,张黎,等.双氢青蒿素和吉非替尼联用对肺癌NCI-H1975细胞凋亡相关蛋白Bax与Bcl-2表达的影响[J].中国老年学杂志,2019,39(23):5806-5810.

[19] 吕冰洁,赵洁,郝东,等.SPK1通过调节Bcl-2/Bax途径干扰LLC细胞凋亡[J].中国病理生理杂志,2019,35(5):950-954.

[20] 毛苇,赵心恺,孔灿灿,等.Survivin基因沉默促进胃癌细胞凋亡及其机制研究[J].实用医学杂志,2018,34(19):3176-3180.

[21] Zhou M,Liu X,Li Z,

.Caspase-3 regulates the migration,invasion and metastasis of colon cancer cells[J].Int J Cancer,2018,143(4):921-930.

[22] 谢金玲,卓少元.Vimentin在原发性肝癌发生发展及凋亡过程中的作用[J].中国肿瘤,2017,26(2):130-134.

[23] Liu W,Zhang L,Jin Z,

.TUFT1 is expressed in breast cancer and involved in cancer cell proliferation and survival[J].Oncotarget,2017,8(43):74962-74974.

[24] 李珍杰,李建生,李东颖,等.TUTF1表达对肝癌细胞增殖凋亡及预后的影响[J].中华肝脏病杂志,2019,27(11):879-884.

[25] Dou C,Zhou Z,Xu Q,

.Hypoxia-induced TUFT1 promotes the growth and metastasis of hepatocellular carcinoma by activating the Ca

/PI3K/AKT pathway[J].Oncogene,2019,38(8):1239-1255.

[26] Liu H,Zhu J,Mao Z,

.Tuft1 promotes thyroid carcinoma cell invasion and proliferation and suppresses apoptosis through the Akt-mTOR/GSK3β signaling pathway[J].Am J Transl Res,2018,10(12):4376-4384.