生菜多酚氧化酶的酶活特性及碳点对其抑制作用

李宏，李秋兰，于丽娟，普红梅，杨德志，李雪瑞，杨亚玲*

（1.云南省农业科学院农产品加工研究所，云南 昆明 650033；2.昆明理工大学生命科学与技术学院，云南 昆明 650500）

生菜（Lactuca sativa L.）是叶用莴苣的俗称，质地鲜嫩，清香可生食。生菜具有很高的营养价值，含有多种维生素和矿物质，其中莴苣素具有促进人体血液循环和催眠利尿的作用[1]。食用生菜能够帮助消化，改善便秘[2]。生菜含水量较高，但收获后水分容易蒸发，在贮藏、运输过程中经常发生褐变、腐烂、叶片变黄等现象，不利于其长时间储藏[3]。多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）是在水果、蔬菜发生酶促褐变过程中的主要酶类[4]，其作为一种在自然界中分布广泛的含铜末端氧化还原酶[5-6]，在氧气存在下能催化邻苯二酚氧化成邻苯二醌[7]，醌与植物细胞内蛋白质、氨基酸等物质络合或自身聚合，形成褐色或黑色多聚物醌类物质[8]。国内外关于抑制水果蔬菜PPO活性的研究较多，且已有抑制方法，如降低氧含量的物理方法和添加亚硫酸盐类、含硫有机化合物、抗坏血酸等抑制剂的化学方法[9]。近年来有学者研究表明抗坏血酸、亚硫酸氢钠、柠檬酸对生菜PPO活性有抑制效果[10-11]。

碳点（carbon dots，CDs）是一类尺寸在10 nm以内的球形或类球形的纳米粒子[13]。作为碳纳米材料家族的新成员[14]，自2004年[15-16]发现以来，因其具有原料成本低、易于合成、水溶性好、表面易功能化、环境友善、优越的物化性质等特点[17-19]，引起了各行各界广泛的关注。在生物荧光成像[20]、生物传感[21]、化学分析[22]、光催化[23]等领域得到广泛应用。这些特性与碳点表面的官能团的种类和数量密不可分。碳点表面的还原性基团—OH、—SH等的存在使碳点具备还原性能，使其可应用于PPO抑制。与常用PPO抑制剂相比，其安全性、抑制效果等都具备一定优势。但碳点在PPO抑制剂方面的应用却鲜有研究。

本文对生菜根茎中PPO进行粗提，研究其酶活特性，制备了 3种不同掺杂的碳点（S-CDs、Br-CDs、Cu-CDs），研究了CDs对生菜PPO活性的抑制性能，提供了一种新的PPO抑制剂。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

生菜：市售。谷胱甘肽、十六烷基三甲基溴化铵、柠檬酸、磷酸氢二钠、邻苯二酚、间苯二酚、对苯二酚、苯酚、邻苯三酚、抗坏血酸、尿素、甘氨酸、乙二胺四乙酸二钠铜（ethylenediaminetetraacetic acid copper disodium salt，EDTACu-2Na）：阿拉丁试剂上海有限公司，以上试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

SX2-5-12马弗炉：上海力辰邦西仪器科技有限公司；T-50.1 L砂芯溶剂过滤器（滤头孔径10 μm）：天津市津腾实验设备有限公司；TU-1901双光束紫外可见分光光度计：北京通用分析仪器有限公司；HH-4型恒温水浴锅：金坛市富华电器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 碳点合成

分别以谷胱甘肽、十六烷基三甲基溴化铵、乙二胺四乙酸二钠铜为原料，采用水热法[24-25]制备硫掺杂、溴掺杂、铜掺杂的碳点（S-CDs、Br-CDs、Cu-CDs）。

将1.5 g谷胱甘肽溶解于100 mL蒸馏水中，待完全溶解后将溶液转移到聚四氟乙烯内衬的反应釜中，再置于马弗炉中，在200℃的温度下反应8 h。反应结束后取出，自然冷却至室温。再使用砂芯溶剂过滤器加0.2 μm的滤膜真空抽滤，然后将溶液转移至离心管中，在转速为10 000 r/min条件下离心30 min。待离心结束弃掉下层沉淀，所得上清液即为S-CDs，制备好的溶液置于4℃下保存备用。

Br-CDs制备：称取十六烷基三甲基溴化铵1.82 g和尿素0.606 g、甘氨酸0.75 g溶解于40 mL蒸馏水中，完全溶解后将溶液转移到聚四氟乙烯内衬的反应釜中，再置于马弗炉中，在200℃的温度下反应8 h。冷却后处理步骤与S-CDs一致。

Cu-CDs制备：称取0.4 g乙二胺四乙酸二钠铜，溶解于40 mL水中，加入0.1 g柠檬酸和100 μL乙二胺，溶解后转移至聚四氟乙烯内衬的反应釜，于马弗炉中200℃反应8 h。冷却后处理步骤与S-CDs一致。

1.3.2 生菜PPO提取方法

参考胡金强等[11]的方法，对生菜根茎的PPO进行粗提。将新鲜的生菜根部迅速去皮，取25g样品，加入50 mL磷酸缓冲液（4℃预冷，pH值为7，浓度50 mmol/L），制成匀浆，在4℃，转速8 500 r/min的冷冻离心机上离心15 min，取上清液即为生菜PPO粗提液。

1.3.3 生菜PPO活性的测定

以0.3 mL邻苯二酚（浓度为0.3 mol/L）为底物，取2.6 mL的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液（pH值为6）与之混匀，加入0.1 mL的酶粗提液，40℃反应10 min，于420 nm处测定产物的吸光度，表示其活性大小。

1.3.4 底物专一性

在2.6 mL缓冲液（pH值为6.2）和0.1 mL酶粗提液的混合溶液中分别加入0.3 mL不同的酚（对苯二酚、间苯二酚、邻苯二酚、邻苯三酚、苯酚，浓度均为0.3 mol/L）作为底物，混匀，在21℃条件下水浴加热10 min，测定420 nm处吸光度。

1.3.5 反应pH值对生菜PPO活性的影响

配制不同pH值的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液（pH值在4～8之间），各取2.6 mL于5支试管中，分别加入0.3 mL的邻苯二酚和0.1 mL的生菜PPO粗提液，涡旋混匀后在21℃反应10 min，于420 nm处测定吸光度。

1.3.6 反应温度对生菜PPO活性的影响

取2.6 mL的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液（pH值为6）和0.3 mL的邻苯二酚与0.1 mL的PPO混匀后，于不同温度（4、10、20、30、40、50、60 ℃）下加热 10 min，在420 nm处测定吸光度。

1.3.7 不同抑制剂对生菜PPO活性的影响

在2.6 mL柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液（pH值为6）、0.3 mL邻苯二酚和0.1 mL酶粗提液的混合体系中分别加入0.5 mL质量浓度为1 mg/mL的柠檬酸、抗坏血酸、半胱氨酸、S-CDs、Br-CDs、Cu-CDs溶液。旋涡混匀后于40℃反应10 min，于420 nm处测定吸光度。以不加抑制剂时的酶活为对照，加抑制剂时的酶活与不加入抑制剂时的酶活的比值表示抑制效果，低于对照组（不加抑制剂）即相对活性小于100%表示有抑制效果。

2 结果与分析

2.1 碳点的结构表征

为了了解S-CDs的形貌及其结构特征，对碳点进行了透射电子显微镜（transmission electron microscope，TEM）和傅里叶红外光谱（Fourier transform infrared，FTIR）、X射线光电子能谱仪（X-ray photoelectron spectroscopy，XPS）表征，结果如图1所示。

图1 S-CDs的表征图谱Fig.1 Characterization spectras of S-CDs

从图1a中可以看出，合成的S-CDs呈球形，且粒径均匀，分散性较好，粒径分布大约为（2.8±0.4）nm。由图1b可知，3 404 cm-1处左右的宽峰对应O—H、N—H的伸缩振动[26]；在 2 929、2 302 cm-1处的峰对应 C—H和 S—H 的伸缩振动；在 1 656、1 546、1 382、1 151 cm-1及 1 031 cm-1处的峰对应 C O、C C、C—N、C—S及C—O的伸缩振动[27]。结果表明了S-CDs表面—OH、—COOH、—NH2及—SH的存在。由图1c可知，在285、400、532、164 eV 处有 4 个峰，分别对应于 C 1s、N 1s、O 1s、S 2p，证明了 S-CDs中 C、N、O 及 S 原子存在[28]。

2.2 底物专一性

不同类型的多酚氧化酶具有不同的底物特异性，为了研究生菜PPO的底物专一性，选取了单酚（苯酚）、二酚（邻苯二酚、间苯二酚、对苯二酚）、邻苯三酚为底物，考察其催化活性和速率变化，在相同条件下以对苯二酚、间苯二酚、邻苯二酚、邻苯三酚、苯酚为底物，经生菜PPO的催化氧化，在420 nm处测吸光度，结果如图2所示。

图2 生菜PPO对不同酚类底物的催化氧化Fig.2 Oxidation of different phenolic substrates under the catalysis of PPO from Lactuca sativa L.

研究结果表明，生菜多酚氧化酶不具有底物专一性。由图2a可知，以邻苯二酚为底物时产物吸光度最高，这表示在相同催化反应时间下，生菜PPO对邻苯二酚的催化速度最快，这可从图2b的结果得到证实。以对苯二酚和邻苯三酚作为底物的酶促反应催化速率大约只是其速率的一半，而以间苯二酚和苯酚为底物时其催化氧化活性不明显。证明以这5种酚类为底物，生菜PPO对邻苯二酚的亲和力和催化活性最高，所以选择邻苯二酚作为生菜PPO的主要氧化底物进行后续研究。

2.3 反应pH值对生菜PPO活性的影响

不同pH值条件下测定的PPO酶活性大小不同，室温条件下，采用邻苯二酚为底物测定不同pH值对生菜PPO酶活的影响，结果如图3所示。

图3 pH值对生菜PPO活性的影响Fig.3 Effect of pH value on the PPO activity of Lactuca sativa L.

由图3可知，酸碱度过强都会对生菜PPO的活性产生明显的抑制，相对而言酸性对其活性的影响较大。当pH值为6时，生菜PPO的活性最强；当pH值小于6时，PPO活性减弱，这可能是因为PPO作为一种碱性蛋白质，在强酸性条件下会解离出配基Cu2+，继而使酶失去活性；当pH值大于6时，PPO的活性随着pH值的增加而降低，这可能是因为碱性条件下，PPO的配基Cu2+会以氢氧化铜的形式存在而沉淀，使得酶的活性降低[29]。该酶的最适pH值为6，在储藏过程中应该控制环境的pH值在4左右来抑制酶促褐变。

2.4 反应温度对生菜PPO活性的影响

反应温度对于PPO活性有一定影响。为了研究生菜PPO的最适反应温度，测试了不同反应温度下生菜PPO对邻苯二酚的催化反应程度，结果如图4所示。

图4 反应温度对生菜PPO活性的影响Fig.4 Effect of temperature on the PPO activity of Lactuca sativa L.

由图4可知，随反应温度的升高，生菜PPO活性呈现出先上升后下降的趋势。可以看出该酶的最适反应温度为40℃，反应温度小于40℃时，生菜PPO活性随着反应温度的升高而升高，这是因为反应温度升高加快了反应速率；反应温度大于40℃时，酶活性随着反应温度的升高而降低，这是因为高温破坏了酶的结构，导致其活性部位完整性的损坏，从而使酶失去活性[30-32]。

2.5 抑制剂筛选

3种常用于水果蔬菜保鲜中PPO的抑制剂以及实验室合成的3种掺杂碳点，对于生菜PPO活性抑制的效果如图5所示。

图5 不同抑制剂对生菜PPO活性的影响Fig.5 Effect of inhibitor on PPO activity of Lactuca sativa L.

由图5可知，S-CDs的生菜PPO抑制效果最好，抗坏血酸效果仅次于S-CDs，柠檬酸再次之，Cu-CDs抑制效果较差，而Br-CDs以及半胱氨酸对生菜PPO活性并无明显抑制。这可能是因为抗坏血酸可作醌的还原剂，又可以作为铜离子的螯合剂，可将酶络合的Cu2+还原为Cu+，从而抑制酶活性[33]；柠檬酸通过降低反应体系的酸碱度来抑制酶活性[34]；而S-CDs表面的—OH、—SH及—NH2与多酚氧化酶的辅基Cu2+螯合，起到竞争性抑制作用。由图5b～5d可以看出，在浓度均为0.1 mg/mL时，在S-CDs作用下生菜PPO的活性只有55%，而抗坏血酸和柠檬酸作用下，其活性分别为57%和78%；当浓度到达0.3 mg/mL时，而在柠檬酸和抗坏血酸作用下，生菜PPO活性分别还剩下30%和20%，而在S-CDs作用下，生菜PPO活性仅为10%。这些结果再一次证明S-CDs对生菜PPO具有较强的抑制效果。

3 结论

生菜的褐变与生菜PPO的催化活性有着不可分割的关系，了解PPO的特性旨在更好的控制酶促褐变的发生。本研究初步考察了不同底物、不同pH值和不同温度对PPO活性的影响。研究结果表明，生菜PPO的主要氧化底物是邻苯二酚，并且以邻苯二酚作为底物，得到该酶的最适缓冲液pH值为6，最适温度为40℃。通过水热法合成3种不同掺杂的碳点，与3种常用PPO抑制剂进行比较发现：柠檬酸、抗坏血酸、Cu-CDs、S-CDs均能有效抑制生菜PPO活性，其中SCDs及抗坏血酸抑制生菜PPO活性的效果最佳，这可能是由于S-CDs表面含有的还原性—OH、—SH及—NH2对生菜PPO产生好的抑制效果，这区别于其他CDs和常规抑制剂，且当S-CDs浓度为0.3 mg/mL时，生菜PPO已基本失活。