血管生成拟态在翼状胬肉进展中的作用及可能机制

贺梦璇 唐秋阳 张俊芳 杨 铃 秦 柏 顾宏卫 管怀进 石海红

翼状胬肉是常见的眼表疾病之一，临床上表现为睑裂区呈翼状的纤维血管组织增生侵入角膜，常影响美观，可导致干眼、角膜散光[1]、视力下降，若增生组织遮盖视轴则会严重影响患者的生活质量。翼状胬肉具有许多肿瘤样特性，包括轻度发育不良、局部浸润、术后易复发、微卫星不稳定性及杂合性丢失[2]等，故部分学者认为其是一种肿瘤样病变。血管生成拟态(VM)是最新发现的肿瘤微循环模式，它是由高度侵袭性的肿瘤细胞通过自身变形及细胞外基质重塑形成，管腔无内皮细胞衬覆，且可与宿主血管相连通使肿瘤获得血液供应[3-4]。有研究发现，VM也存在于翼状胬肉组织中，参与翼状胬肉的血液供应[5]。本研究通过统计不同类型翼状胬肉中VM的阳性率并对比VM阳性组和VM阴性组患者的翼状胬肉临床病理特征及相关分子的表达，进一步探讨VM与翼状胬肉进展的相关性及其形成的可能机制。

1 资料与方法

1.1 材料

1.1.1 标本获取选取2019年1月至2020年1月于南通大学附属医院眼科行翼状胬肉切除手术的初发型翼状胬肉标本125例，以及2017年1月至2020年12月于本院行同一手术的复发型翼状胬肉标本54例，另选取10例于本院捐献眼球的正常结膜组织作为对照。收集患者的性别、年龄、病程等一般资料。所有翼状胬肉患者病灶均位于鼻侧，且排除其他眼表疾病及眼部外伤史、手术史或长期用药史，手术均由同一医生完成，所取标本均为完整的翼状胬肉组织。对照组受试者均无眼表疾病，无眼部外伤史、手术史或长期用药史。本研究遵循《赫尔辛基宣言》原则，通过南通大学附属医院伦理委员会审查批准，患者均签署知情同意书。

1.1.2 主要试剂与仪器苏木精-伊红染色试剂、DAB显色试剂盒(北京中杉金桥有限公司)，GTVisionTMIII抗鼠/抗兔通用型免疫组织化学检测试剂盒(上海基因科技有限公司)，CD31抗体、VEGF抗体(英国Abcam公司)，基质金属蛋白酶-2(MMP-2)抗体、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)抗体(美国GeneTex公司)，柠檬酸钠抗原修复液、过碘酸-雪夫染色试剂盒、蛋白抽提试剂盒、BCA蛋白浓度检测试剂盒、SDS-PAGE凝胶配制试剂盒、抗体稀释液及增强化学发光反应检测试剂盒(北京索莱宝有限公司)。DM3000光学显微镜及显微摄像系统(德国Leica公司)。

1.2 方法将术中取下的正常结膜及翼状胬肉组织每份均取一半冻存用于Western blot检测，另一半使用40 g·L-1多聚甲醛固定，常规脱水，石蜡包埋，制成厚度约为4 μm的切片，用于病理学观察。

1.2.1 翼状胬肉分组标准静止期翼状胬肉：头部扁平，角膜浸润不明显或无浸润，颈部及体部菲薄，不充血，血管纤细，表面光滑；进展期翼状胬肉：胬肉头部隆起，不同程度的角膜浸润，颈部及体部肥厚，血管较正常结膜组织充血、扩张，表面不光滑。初发型翼状胬肉：初次形成的翼状胬肉；复发型翼状胬肉：手术切除后，再次形成的翼状胬肉。

1.2.2 CD31/PAS双重染色切片脱蜡至水，65 ℃烘箱中干燥40 min，PBST(含0.5 g·L-1Triton-100的PBS溶液)漂洗，柠檬酸钠缓冲液抗原修复15～20 min，PBST漂洗，体积分数3%H2O2消除内源性过氧化物酶活性20 min(避光)，PBST漂洗，体积分数10%山羊血清封闭40 min，不洗，加入CD31(150)一抗，4 ℃孵育过夜。复温，PBST漂洗，滴加HRP标记聚合物37 ℃孵育30 min，PBST漂洗，DAB显色，蒸馏水浸洗，高碘酸氧化5 min，蒸馏水浸洗，Schiff液避光染色10 min，蒸馏水浸洗，苏木素染核5 min，稀盐酸酒精分化2～5 s，自来水漂洗，蒸馏水返蓝，梯度酒精脱水，二甲苯透明，自然干燥后中性树胶封片，光学显微镜下观察并采集图像。

1.2.3 HE染色以临床上最常见的初发型进展期翼状胬肉为研究对象，将VM阳性者作为VM阳性组，VM阴性者作为VM阴性组，随机选取20例VM阳性组及20例VM阴性组的翼状胬肉标本进行HE染色。将切片置于65 ℃烘箱中干燥40 min，PBS漂洗，苏木素染色5 min，PBS漂洗，稀盐酸酒精分化，自来水漂洗，蒸馏水返蓝，伊红染液染色5 min，洗去浮色，脱水，透明，封片，显微镜下观察。

1.2.4 免疫组织化学染色对1.2.3中各切片进行免疫组织化学染色。抗原修复，消除内源性过氧化物酶活性，封闭，孵育一抗(MMP-2稀释度为 1400；MMP-9稀释度为1100；VEGF稀释度为1100)，孵育二抗，DAB显色，苏木素染核，分化，返蓝，脱水，透明，封片，显微镜下观察。随机选择5个高倍视野，以镜下颜色强度及阳性细胞百分比予以评分。无色计为0分，淡黄色计为1分，棕黄色计为2分，棕褐色计为3分。阳性细胞百分比：0%～5%计为0分，>5%～25%计为1分，>25%～50%计为2分，>50%～75%计为3分，>75%计为4分。两项得分相乘，0分计为 “-”，1～4分计为 “+”，5～8分计为 “++”，9～12分计为 “+++”。

1.2.5 Western blot检测在初发型进展期翼状胬肉标本中，随机选取VM阳性组、VM阴性组各3例冻存标本，利用蛋白抽提试剂盒提取总蛋白，BCA法测定蛋白浓度，制备100 g·L-1SDS-PAGE凝胶，每孔加入20 μg蛋白样品，常规电泳、转膜、封闭，随后分别加入兔抗人MMP-2抗体(稀释度为1500)、兔抗人MMP-9抗体(稀释度为1500)、鼠抗人VEGF抗体(稀释度为13000)及鼠抗人GAPDH抗体(稀释度为15000)，4 ℃孵育12 h后，TBST漂洗，加入相应二抗(稀释度为15000)室温孵育1 h，化学发光法显影，成像系统拍照，ImageJ软件分析各组灰度值。

1.2.6 翼状胬肉临床特征评价指标翼状胬肉临床特征评价指标参见文献[6]。其中，翼状胬肉血管分为3级，分别为1级：翼状胬肉的体部薄如蝉翼，轻度充血，血管纤细，呈淡红色；2级：翼状胬肉的体部肥厚，血管扩张，密度增高，呈红色；3级：翼状胬肉体部明显肥厚，血管怒张、致密，呈深红色。翼状胬肉透明度分为3级，分别为1级：透过翼状胬肉体部能看清其下巩膜血管；2级：翼状胬肉体部下巩膜血管欠清晰，少量可见；3级：从翼状胬肉体部不能透见巩膜血管。

1.2.7 翼状胬肉病理特征评价指标翼状胬肉病理特征评价指标参见文献[7]。分别于40倍显微镜下随机观察5个不同视野，记录上皮细胞层数、杯状细胞数、成纤维细胞数、血管数及炎症细胞数，均取平均值。纤维化程度分为4级，分别为0级：无纤维化；1级：少量血管周纤维化；2级：较多的血管周及局灶性纤维化；3级：弥漫性纤维化。变性程度分为4级，分别为0级：无弹性组织变性；1级：少量弹性组织变性；2级：较多的弹性组织变性；3级：弥漫性弹性组织变性。

1.3 统计学分析采用SPSS 23.0软件进行统计学分析。计数资料采用χ2检验。等级资料采用Mann-WhitneyU检验。双变量相关性分析采用Spearman等级相关。计量资料采用独立样本t检验。检验水准：α=0.05。

2 结果

2.1 翼状胬肉中VM的表达CD31/PAS双重染色结果(图1)显示，血管内皮细胞CD31阳性(棕黄色)、血管壁PAS阳性(紫红色)为具有血管内皮细胞的血管，而CD31阴性、PAS阳性的管道状结构是VM的特有形态。经分析，10例正常结膜均未见VM结构，静止期翼状胬肉中VM阳性率为15.38%(8/52)，进展期翼状胬肉中VM阳性率为68.50%(87/127)，静止期与进展期翼状胬肉中VM阳性率相比差异有统计学意义(P=0.000)；初发型翼状胬肉中VM阳性率为40.80%(51/125)，复发型翼状胬肉中VM阳性率为81.48%(44/54)，初发型与复发型翼状胬肉中VM阳性率相比差异有统计学意义(P=0.000)(表1)。相关性分析结果显示，VM与进展期翼状胬肉(r=0.483，P<0.05)及复发型翼状胬肉(r=0.374，P<0.05)均呈正相关。

表1 翼状胬肉中VM与患者临床资料的关系

2.2 翼状胬肉中VM的表达与患者一般资料的关系统计得出，在不同性别、年龄及病程的翼状胬肉患者的胬肉组织中，VM的表达差异均无统计学意义(均为P>0.05)(表1);翼状胬肉分期、分型中VM的表达差异均有统计学意义(均为P=0.000)。

2.3 翼状胬肉中VM与临床特征的关系将翼状胬肉的血管情况及透明度纳入评价翼状胬肉临床特征的指标，结果显示，在初发型进展期翼状胬肉VM阳性组中，翼状胬肉的血管分级明显高于VM阴性组(P=0.000)，且VM与翼状胬肉血管分级呈正相关(r=0.651，P<0.001)，而透明度分级在两组间差异无统计学意义(P=0.635)(表2)。

表2 VM阳性组和VM阴性组翼状胬肉组织的临床病理特征差异分析

2.4 翼状胬肉中VM与病理特征的关系HE染色可见(图2)，在初发型进展期翼状胬肉中，VM阳性组翼状胬肉组织的上皮细胞层数、杯状细胞数、成纤维细胞数、血管数、炎症细胞数、纤维化程度均明显高于VM阴性组(均为P<0.01)，而VM阴性组翼状胬肉组织的变性程度高于VM阳性组(P=0.049)(表2)。相关性分析结果显示，VM与翼状胬肉组织的上皮细胞层数(r=0.846，P<0.001)、杯状细胞数(r=0.868，P<0.001)、成纤维细胞数(r=0.729，P<0.001)、血管数(r=0.764，P<0.001)、炎症细胞数(r=0.799，P<0.001)、纤维化程度(r=0.438，P<0.01)均呈正相关，与变性程度呈负相关(r=-0.642，P<0.05)。

图2 HE染色显示VM阳性组和VM阴性组翼状胬肉组织的病理特征(×400)

2.5 翼状胬肉中VM与MMP-2、MMP-9及VEGF的关系免疫组织化学染色结果显示，翼状胬肉组织中MMP-2主要表达于上皮细胞及血管内皮细胞，MMP-9主要定位于上皮基底细胞、血管内皮细胞及成纤维细胞，VEGF主要于血管内皮细胞中表达。采用半定量积分法判定染色强弱，结果显示，VM阳性组翼状胬肉组织中MMP-2、MMP-9及VEGF的表达均明显高于VM阴性组，差异均有统计学意义(均为P<0.05)(图3，表3)。

Western blot检测结果显示，VM阳性组翼状胬肉组织中MMP-2、MMP-9及VEGF的表达均明显高于VM阴性组，差异均有统计学意义(t=19.419、16.535、13.000，均为P=0.000)(图4)，与免疫组织化学染色结果相同。相关性分析结果显示，翼状胬肉中VM与MMP-2、MMP-9及VEGF的表达均呈正相关(r=0.367、0.378、0.329，均为P<0.05)。

表3 翼状胬肉中VM与MMP-2、MMP-9及VEGF表达的关系

图4 Western blot检测VM阳性组和VM阴性组翼状胬肉组织中MMP-2、MMP-9及VEGF的蛋白表达 与VM阴性组相比，***P<0.001。

3 讨论

翼状胬肉是一种慢性退行性炎性病变，是眼科的常见病和多发病。李永平等[5]利用CD34/PAS双重染色首次在翼状胬肉组织中发现VM结构，但由于CD34在正常角膜缘和巩膜组织中的纤维细胞也有阳性表达，故我们的研究选择CD31/PAS双重染色进一步重新验证了翼状胬肉中VM的存在，这与肿瘤组织中VM结构的检测方法一致。

本研究结果显示，翼状胬肉中存在VM结构，而正常结膜中未见，且进展期翼状胬肉中VM阳性率大于静止期，复发型翼状胬肉中VM阳性率大于初发型。我们的研究结果与李永平等[5]的结论共同支持了“VM结构不是肿瘤组织所独有的血供模式”这一观点。我们推测，VM是由于机体局部组织由于某些原因需要大量的营养供应，但自身血管不能满足其需要而形成的一种供给方式。在进展期及复发型翼状胬肉中，尤其是复发型翼状胬肉，病灶进展速度快，需要较多的血液供应，故VM形成率较高。同时，大量VM结构的产生使翼状胬肉获得了充分的血液供应，极大地促进了翼状胬肉的进展。

组织病理学上，眼表微环境的稳态主要由角膜缘干细胞维持，在紫外线或某些细胞因子等的作用下，角膜缘干细胞增殖、分化紊乱，即可导致眼部疾病的发生[8]。翼状胬肉的典型病理特征包括上皮细胞增生、杯状细胞增生、新生血管形成、炎症细胞浸润、成纤维细胞增生、纤维化及弹性组织变性等[9]。本研究通过对初发型进展期VM阳性和VM阴性翼状胬肉的病理指标观察发现，VM阳性组翼状胬肉的上皮细胞层数及杯状细胞数增加。有研究表明，翼状胬肉凸出于眼表，破坏了泪膜的完整性，使角膜不能得到足够的氧气和营养供应，因此导致上皮细胞及杯状细胞增生，分泌黏蛋白，维持泪膜的稳定。我们认为，VM阳性的翼状胬肉组织具有较多的血管、炎症细胞数及成纤维细胞，长势较凶猛，其对泪膜的破坏更为严重，故其上皮细胞及杯状细胞的增生较VM阴性组更为明显。研究表明，许多细胞因子可通过激活ERK、p38/MAPK及JNK信号通路刺激杯状细胞增生[10]，其中p38/MAPK及JNK信号通路还与炎症密切相关，即杯状细胞增生常伴有不同程度加重的炎症反应，这与我们发现的VM阳性的翼状胬肉杯状细胞增生同时伴有炎症细胞数增加这一结论相呼应。

李永平等[5]指出，翼状胬肉中VM主要表现为PAS阳性的细胞外基质包绕在成纤维细胞伸出的突起表面形成的管道状结构，即成纤维细胞是构成VM的主要成分之一，故VM阳性的翼状胬肉可能具有较多的成纤维细胞。增生的成纤维细胞可产生过量的弹性蛋白，故VM阳性组翼状胬肉的纤维化程度也较VM阴性组明显。此外，成纤维细胞还可分泌如MMPs、VEGF、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)等多种促进翼状胬肉血管生成及炎症反应的细胞因子，因此，VM阳性组翼状胬肉中血管分级、血管数及炎症细胞数也均高于VM阴性组。黄丽娜等[10]提出，进展期翼状胬肉中基质浅层血管密度、成纤维细胞数、炎症细胞数及纤维增殖程度均高于静止期翼状胬肉，复发型翼状胬肉中这些病理指标又均高于初发型翼状胬肉，即这些病理指标与翼状胬肉的发生发展密切相关。故我们有理由推测，VM也与翼状胬肉的发生发展密切相关。

本研究还发现，VM阳性组翼状胬肉变性程度较低，可能是因为变性区域血管、炎症细胞及成纤维细胞均较少，即此区域所需要的血液供应较少，不需要机体形成VM结构来补充养分，故变性程度越高的翼状胬肉组织VM结构出现的越少。而VM与翼状胬肉透明度无相关性，可能是因为血管密度及胶原纤维变性程度均可影响翼状胬肉的透明程度。血管密度增加，翼状胬肉的透明度降低，VM表达较多；变性程度增加，翼状胬肉透明度同样降低，而VM表达减少。

肿瘤VM的形成机制较为复杂，研究表明，MMPs几乎能降解肿瘤细胞外基质所有的蛋白成分，在肿瘤侵袭和转移中起关键性作用，且VM与MMPs表达量呈显著正相关[11-12]。此外，在脉络膜黑色素瘤组织中，VM阳性组织VEGF的表达均明显高于VM阴性组织，且VEGF可以提高人类脉络膜黑色素瘤细胞迁移、侵袭及VM形成能力；VEGF能够激活PI3K，进而刺激MMP前体形成MMPs，共同促进肿瘤细胞形成VM[13-14]。与肿瘤组织相同，翼状胬肉组织中MMP-2、MMP-9和VEGF的表达均明显高于正常结膜组织[15-16]。MMPs是一类与翼状胬肉迁移和侵袭密切相关的蛋白水解酶，具有降解细胞外基质蛋白和基底膜中纤维网架分子的作用[17]，使翼状胬肉中的细胞向角膜及深层浸润。VEGF是目前发现的功能最强、最特异的促进血管形成的生长因子，具有促进血管通透性增加、细胞外基质变性、血管内皮细胞迁移和增殖等作用[18]。此外，VEGF与MMPs在翼状胬肉形成过程中具有协同作用，共同参与翼状胬肉的发展。

本研究结果发现，VM阳性组翼状胬肉组织中MMP-2、MMP-9及VEGF的表达均明显高于VM阴性组，且VM与MMP-2、MMP-9及VEGF的表达均呈显著正相关，即VM阳性的翼状胬肉具有更强的促进翼状胬肉细胞外基质蛋白降解、溶解角膜前弹力层及新生血管的能力，极大地促进了翼状胬肉的进展。此外，有研究表明，进展期翼状胬肉组织中MMP-2、MMP-9和VEGF的表达均明显高于静止期，复发型翼状胬肉组织中MMP-2、MMP-9和VEGF的表达又明显高于初发型，即MMP-2、MMP-9和VEGF的高表达与翼状胬肉发生发展密切相关[19]。故我们推测，VM也与翼状胬肉的进展密切相关，MMP-2、MMP-9及VEGF可能参与翼状胬肉VM的形成。

综上所述，翼状胬肉组织中存在VM结构，可作为其血供途径之一，VM可促进翼状胬肉的进展，MMP-2、MMP-9及VEGF可能是翼状胬肉VM形成的分子机制。本研究也存在一定不足，由于半定量积分法判定染色强弱具有一定的主观性，可能使试验结果产生一定的误差。此外，病例的地域局限性也可能对结果造成一定偏倚，仍需多中心、大样本临床研究来支持结论。

致谢：感谢南通大学附属医院眼科及眼科研究所全体老师在本研究工作上的支持与指导！