过表达TBK1通过调控RIPK1信号通路对糖尿病大鼠视网膜神经节细胞凋亡的抑制作用△

张 俏 罗 影 刘学政

糖尿病视网膜病变(DR)引起的视力进行性损害与累及眼底的大量纤维血管增生以及视网膜神经元的凋亡有关[1]。然而，仅仅干预微血管病变并不能阻止DR[2]。视网膜神经节细胞(RGC)的死亡早于微血管损伤，这主要依赖于半胱氨酸蛋白酶(Caspase)的细胞内过程，抗凋亡治疗可能是防治DR的潜在靶点[3-4]。TANK结合激酶1(TBK1)为一种多功能激酶，在细胞中发挥广泛功能，包括先天免疫、凋亡和炎症信号等[5]。研究显示，TBK1能抑制衰老过程中由受体相互作用蛋白激酶1(RIPK1)驱动的细胞凋亡和炎症[6]。而DR亦属于神经退行性疾病范畴，TBK1可能在DR中具有重要作用，目前具体机制尚未完全清楚。因此，本研究拟探讨TBK1的表达变化及其调控可能对糖尿病状态下视网膜神经元凋亡的影响，为其对DR防治提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物分组及模型制备雄性SD大鼠60只，体重220～240 g (购自锦州医科大学)。大鼠按60 mg·kg-1腹腔一次性注射链脲佐菌素(STZ)，72 h后检测尾静脉空腹血糖，大于16.7 mmol·L-1者视为糖尿病模型造模成功。模型制备完成后，随机分成三组：糖尿病(DM)组、TBK1过表达组(TBK1-OE组，大鼠玻璃体内单次注射TBK1过表达慢病毒载体5 μL，病毒滴度为 1.0×109IU·mL-1)、TBK1空载体组(TBK1-NC组，玻璃体内注射等剂量病毒包装的阴性对照液)，另取正常大鼠作为对照(CON)组，每组15只。CON组、DM组大鼠灌胃等剂量PBS缓冲液。12 周后，进行各项指标检测。实验遵循国家《实验动物管理条例》。

1.1.2 主要试剂及仪器STZ(美国Sigma公司)；TBK1 慢病毒(上海吉玛公司，正义链：5’-AACCGTCTCATTAAGATAGC CGATCTTGGTGTGGC-3’； 反义链：5’-AACCGTCTCGAATTCTTAGCTCTGGC TGGCAC-3’)、兔抗大鼠TBK1一抗、小鼠抗大鼠转录因子Brn3蛋白、兔抗大鼠RIPK1一抗、小鼠抗大鼠Caspase-3一抗 (英国Abcam公司)；肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-1β(IL-1β)ELISA检测试剂盒、Hoechst 33342染色试剂盒、山羊抗兔Alexa 488、山羊抗小鼠Alexa 594 (北京碧云天公司)；荧光倒置显微镜(日本Olympus公司)；冰冻切片机(德国Slee公司)；水平电泳仪(美国BIO-RAD公司)。

1.2 方法

1.2.1 样本制作12 周后，每组取5只大鼠，40 g·L-1多聚甲醛灌注取出眼球并进行冰冻切片，厚度为10 μm，用于免疫荧光染色及Hoechst 33342染色。再取5只大鼠提取视网膜组织，进行ELISA实验。每组余5只大鼠提取视网膜组织，剪碎超声后 4 ℃ 离心30 min后取上清，进行Western blot检测。

1.2.2 免疫荧光染色检测各组大鼠视网膜TBK1蛋白表达定位切片用PBS洗涤3次，每次10 min；3 g·L-1Triton X-100孵育30 min,PBS洗3次，每次10 min；5 g·L-1山羊血清室温孵育30 min，不洗；滴加兔抗大鼠TBK1 (1200)+小鼠抗大鼠Brn3a(1200)，4 ℃ 过夜，PBS洗3次，每次10 min；滴加二抗(山羊抗兔Alexa 488+山羊抗小鼠Alexa 594)，室温60 min，PBS洗3次，每次10 min；用含DAPI的封片剂封片，荧光显微镜拍照。

1.2.3 Hoechst 33342染色检测各组大鼠RGC凋亡切片用PBS洗3次，每次10 min；滴加Hoechst 33342染色检测，室温5 min，PBS洗3次，每次10 min；抗荧光封片剂封片，荧光显微镜拍照。

1.2.4 ELISA检测各组大鼠视网膜TNF-α、IL-6、IL-1β含量收集各组大鼠视网膜，每孔100 μL ，设复孔，按照大鼠 TNF-α、IL-6、IL-1β 的 ELISA 试剂盒说明书进行操作。酶联免疫检测仪在波长 450 nm 下测量光密度，获取各组大鼠视网膜中TNF-α、IL-6、IL-1β含量。

1.2.5 Western blot检测各组大鼠视网膜TBK1、RIPK1、Caspase-3蛋白相对表达量BCA法测定蛋白浓度，电泳、转膜后10 g·L-1BSA室温封闭2 h；加入一抗[兔抗大鼠TBK1(12000),兔抗大鼠RIPK1(15000),小鼠抗大鼠Caspase-3(110 000)]，4 ℃孵育过夜，TBST洗4次，每次5 min；加入二抗2 h，TBST洗4次，每次5 min；显影后ImageJ 软件分析灰度值。

1.3 统计学方法采用SPSS 20.0 统计学软件进行统计分析，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD检验，所有数值均用均数±标准差表示，检验水准：α=0.05。

2 结果

2.1 TBK1在RGC中的表达通过TBK1和Brn3a免疫荧光双标确定TBK1在RGC中特异表达，提示TBK1对视网膜损伤的保护作用是通过RGC实现的(图1)。

图1 免疫荧光染色检测各组大鼠RGC中TBK1的表达 A:TBK1的阳性表达 (绿色：Alexa 488荧光标记)；B:Brn3a(RGC标志物)阳性表达(红色：Alexa 594荧光标记)；C:DAPI染色(细胞核)；D:共存(A+B+C)。箭头示阳性染色。

2.2 Hoechst 33342染色检测各组大鼠RGC细胞凋亡与CON组RGC凋亡率[(2.15±0.54)%]相比，DM组、TBK1-OE组及TBK1-NC组RGC凋亡率[(8.26±0.83)%、(4.65±0.64)%、(8.42±0.86)%]均明显增加(均为P<0.01)；与DM组相比，TBK1-OE组RGC凋亡率明显降低(P<0.01)；而DM组与TBK1-NC组之间RGC凋亡率差异无统计学意义(P>0.05)(图2)。

图2 Hoechst 33342染色检测各组大鼠RGC凋亡情况 A:CON组；B:DM组；C:TBK1-OE组；D:TBK1-NC组。箭头示凋亡细胞。

2.3 ELISA检测各组大鼠视网膜TNF-α、IL-6、IL-1β含量与CON组相比，DM组、TBK1-OE组及TBK1-NC组大鼠视网膜TNF-α、IL-6、IL-1β含量均明显增加(均为P<0.01)；与DM组相比，TBK1-OE组TNF-α、IL-6、IL-1β含量均明显降低(均为P<0.01)；而DM组与TBK1-NC组之间大鼠视网膜TNF-α、IL-6、IL-1β含量差异均无统计学意义(均为P>0.05)(表1)。

表1 各组大鼠视网膜TNF-α、IL-6、IL-1β含量

2.4 Western blot 检测各组大鼠视网膜TBK1、RIPK1、Caspase-3蛋白相对表达量与CON组相比，DM组及TBK1-NC组RIPK1、Caspase-3蛋白相对表达量均明显增加(均为P<0.01)，TBK1蛋白相对表达量均明显降低(均为P<0.01)；TBK1-OE组以上三种蛋白相对表达量均增加(均为P<0.01);与DM组相比，TBK1-OE组RIPK1、Caspase-3蛋白相对表达量均明显降低(均为P<0.01)，TBK1蛋白相对表达量明显增加(P<0.01)；而DM组与TBK1-NC组之间TBK1、RIPK1、Caspase-3蛋白相对表达量差异均无统计学意义(均为P>0.05)(图3，表2)。

图3 Western blot检测各组大鼠视网膜TBK1、RIPK1、Caspase-3蛋白相对表达量 A:CON组；B:DM组；C:TBK1-OE组；D：TBK1-NC组。

表2 各组大鼠视网膜TBK1、RIPK1、Caspase-3蛋白相对表达量

3 讨论

DR患者除了微血管损伤外，神经结构也明显变化，而RGC是遭受损伤的主要成分[7]。与糖尿病相关的并发症会导致RGC结构的不可逆变化，主要是程序性细胞死亡。突变或外部因素的影响可能导致不受控制的增殖或细胞丢失，这会大大加重疾病严重程度[8-9]。本研究结果发现，糖尿病12周后，大鼠RGC凋亡率明显增加，提示造模成功，这为下一步研究奠定基础。

TBK1是一种多功能激酶，在细胞中发挥广泛的功能，包括先天免疫、凋亡和炎症信号等[5,10]。TBK1调控的细胞凋亡在多种疾病中具有关键作用[11-12]。本研究中，免疫荧光染色结果发现，TBK1在大鼠视网膜只表达于RGC内，在糖尿病状态下，视网膜TBK1表达明显降低，RGC凋亡率明显增加。应用慢病毒载体对糖尿病大鼠视网膜TBK1过表达后，RGC凋亡率出现明显降低现象。这提示TBK1在糖尿病时介导RGC的凋亡。此外，进一步检测了大鼠视网膜炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1β含量，糖尿病时三者含量均明显增加，而给予视网膜TBK1过表达后，TNF-α、IL-6、IL-1β含量明显降低，这说明TBK1不仅介导RGC凋亡，还抑制其炎症反应。在衰老和神经退行性疾病模型中，亦发现TAK1可通过抑制疾病引起的神经炎症和凋亡发挥保护作用[6]，但具体机制尚未完全明了。

有文献报道，TBK1的激酶活性可通过促进阿尔茨海默病等多种神经退行性变中小胶质细胞的激活，在介导神经炎症和凋亡中起着核心作用[13]。而其中RIPK1可被TBK1直接抑制，这可直接促进RIPK1依赖性凋亡[14]。细胞凋亡主要依赖于Caspase蛋白家族，这些蛋白积极参与炎症过程和细胞凋亡。Caspase系统的细胞外激活通常源于特异性TNF-α受体的激活，其表现为Caspase-8蛋白的激活，随后Caspase-3的激活启动了凋亡机制[15]。本研究结果发现，糖尿病时RIPK1表达明显增加，而给予TBK1过表达后，RIPK1表达明显降低，同时RGC凋亡率明显下降。这提示TBK1可能通过调控RIPK1表达介导糖尿病时RGC的凋亡。

综上所述，本研究发现过表达TBK1可降低RIPK1表达，这可明显抑制糖尿病状态下大鼠RGC凋亡和炎症。但因糖尿病致病机制复杂，本研究仍存在一些不足，如未能对RIPK1进行干预，从而观察TBK1的功能改变，同时也未能应用免疫共沉淀等技术验证TBK1与RIPK1是否存在直接相互作用，这将在本课题的下一步计划中继续研究。