抗血管内皮生长因子对氧诱导视网膜新生血管病变模型小鼠视网膜多巴胺含量的影响△

崔钰莹 邱 宇 高洪莲 张 磊

早产儿视网膜病变(ROP)是早产儿和低出生体重儿发生的一种视网膜血管增殖性病变，被视为引起儿童视觉受损的重要疾病之一，严重病例可导致视网膜脱离及视力永久丧失[1-2]。早产儿视网膜发育不全，存在大量无血管区，加之高浓度氧气的吸入使视网膜血管缺氧痉挛闭塞，成为视网膜新生血管生成的主要原因，氧诱导视网膜新生血管病变(OIR)模型是模拟ROP最常用模型。缺氧刺激血管生长调控因子分泌，特别是血管内皮生长因子(VEGF)，促进视网膜新生血管的发育，所以玻璃体内注射抗VEGF药物及激光是治疗ROP最主要的方式[3-5]。临床调研发现，经过抗VEGF药物治疗后的ROP患儿视网膜血管网的发育趋近于正常水平，但是却仍然存在视网膜功能异常，后期近视、弱视、斜视的发生率高于同龄期幼儿[6]。

最近研究表明，VEGF除了调节血管生成作用外，还具有神经营养作用，在神经元的发育、修复过程中发挥广泛的作用。有文献报道，VEGF对多巴胺能神经元有营养作用，可促进视网膜上无长突细胞产生多巴胺(DA)[7]。DA是调控眼轴增长和视网膜信号的重要神经递质，其通过改变视网膜电路，在光照环境下驱动视锥细胞，在暗环境中驱动视杆细胞，且对近视的发展具有保护作用[8]。本研究主要通过高流量吸氧建立OIR模型，探讨康柏西普(Conbercept)玻璃体内注射对OIR模型小鼠视网膜DA含量的影响，并分析其可能作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物普通级7 d龄C57BL/6小鼠100只(由北京斯贝福生物技术有限公司提供)，雌雄不限，同母鼠共同养育。自然照明环境下12 h/12 h昼夜循环，自由摄水摄食，维持温度为22～25 ℃，湿度为50%～70%。本实验遵守滨州医学院动物管理委员会制定的动物福利伦理要求，给予人道主义关怀。

1.1.2 主要试剂与仪器Anti-Tyrosine Bydroxylase抗体(美国 Abcam公司ab6211)；VEGF抗体C-1鼠单抗(美国Santa公司 sc-72689)；辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG(H+L)(ZB-2305)、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(H+L)(ZB-2301)购自北京中杉金桥生物有限公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒购自北京兰杰柯科技有限公司；PVDF膜、超敏ECL化学发光检测试剂盒购自默克密理博实验室设备有限公司；PAGE凝胶快速制备试剂盒购自上海雅梅生物医药科技有限公司；苏木素伊红(HE)染色试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司；异硫氰酸荧光素-葡聚糖(FITC-Dextran，相对分子质量 2×106)购自美国Sigma公司；荧光显微镜购自日本Olympus公司。

1.2 方法

1.2.1 动物分组及处理将100只7 d龄小鼠随机分为4组，分别为空白对照组、OIR组、OIR+生理盐水(NS)组及OIR+ Conbercept组，每组25只。空白对照组小鼠于常氧环境中饲养至17 d龄，不做处理。将OIR组、OIR+NS组和OIR+ Conbercept组所有7 d龄C57BL/6小鼠及其喂养母鼠放置于接通体积分数100%湿润医用氧气的密闭容器内，氧流量为0.50～0.75 L·min-1，每日6次使用氧气浓度分析仪检测氧箱内氧浓度，使之维持在体积分数(75±5)%，并在此环境中饲养小鼠至12 d龄，OIR+NS组和OIR+ Conbercept组小鼠分别行右眼玻璃体内注射1 μL NS、1 μL Conbercept后，置于常氧环境中饲养至17 d龄。玻璃体内注射后均用氧氟沙星眼膏涂于术眼，预防感染。

1.2.2 HE染色每组随机选取5只17 d龄小鼠，使用颈椎脱臼法处死，快速取出右眼，于40 g·L-1多聚甲醛中固定2 h，后置于100 g·L-1、200 g·L-1、300 g·L-1蔗糖溶液中脱水。取OCT包埋剂包埋眼球并置于冰冻切片机内冷冻包埋。平行于角膜至视神经的矢状位方向行连续切片，厚度为6 μm。常规脱水后行HE染色，并在光学显微镜下观察视网膜形态。每组标本随机选取20张照片(剔除包含视盘平面者)，计数突破内界膜的视网膜血管内皮细胞核数。

1.2.3 视网膜铺片每组随机选取5只17 d龄小鼠右眼FITC-Dextran荧光造影后行视网膜铺片，荧光显微镜下观察视网膜血管形态变化。将 FITC-Dextran溶于40 g·L-1多聚甲醛中，浓度为50 g·L-1，摇匀。20 g·L-1水合氯醛腹腔注射麻醉小鼠后固定，沿小鼠肋弓打开胸腔，剪开胸骨，分离心脏，于肝上方寻找并阻断腹主动脉。用剪刀剪开右心耳，抽取造影液1 mL，注入小鼠心尖处。以口、鼻、耳廓呈淡黄色为灌注成功。迅速摘出小鼠眼球，置于40 g·L-1多聚甲醛固定30 min。在显微镜下沿角巩膜缘剪开眼球，去除角膜、晶状体及外层巩膜、葡萄膜，置于干净载玻片上铺平，放射状剪开视网膜，用细毛笔轻轻刷去残留的葡萄膜组织，甘油固定封片。取490 nm激发光520 nm滤过波，于荧光显微镜下观察并拍片。

1.2.4 Western blot 检测蛋白表达每组随机选取10只17 d龄小鼠行Western blot检测右眼视网膜中VEGF、酪氨酸羟化酶(TH)蛋白相对表达量。将小鼠颈椎脱臼处死后迅速取出右眼，冰上解剖眼球，剥离出视网膜迅速冷冻于-80 ℃储存。将视网膜组织加入裂解液及蛋白酶抑制剂(1100)后组织匀浆仪裂解，冰上静置30 min后转移至EP 管中，4 ℃ 15 000 r·min-1离心15 min，BCA法测定蛋白浓度。调定各组蛋白浓度后，加入5×蛋白上样缓冲液煮沸10 min。经电泳、转膜后，脱脂奶粉室温封闭2 h，加入一抗(VEGF稀释度为11000；TH稀释度为1500；GAPDH稀释度为 15000)4 ℃孵育过夜，TBST洗膜后，加入二抗室温孵育2 h，TBST冲洗，化学发光法显影，Image Lab软件分析条带灰度值。

1.2.5 高效液相色谱仪检测取各组17 d龄小鼠5只，颈椎脱臼法处死，摘出右眼眼球后，使用显微镜于冰上剥离出视网膜，放入液氮中冷冻。视网膜样品分别称重并记录，组织匀浆后，13 000 r·min-1离心10 min，取上清液进样，高效液相色谱仪及电化学测量器测量视网膜DA含量。

2 结果

2.1 HE染色观察结果空白对照组小鼠视网膜切片HE染色结果显示，视网膜各层排列整齐有序，未见或偶见切片中血管内皮细胞突破内界膜；OIR组小鼠视网膜切片中内界膜处细胞排列紊乱，视网膜各层紊乱，可见较多量突破内界膜的新生血管管腔；OIR+NS组小鼠视网膜切片可见较多量突破内界膜的血管内皮细胞核；OIR+ Conbercept组小鼠视网膜切片可见视网膜各层稍紊乱，有少量血管内皮细胞核突破内界膜，部分切片未见视网膜血管(图1)。空白对照组小鼠视网膜切片中突破内界膜的血管内皮细胞核数为(0.85±0.93)个，OIR组、OIR+NS组小鼠视网膜切片中突破内界膜的血管内皮细胞核数分别为(20.90±2.89)个、(20.70±3.24)个，均较空白对照组明显增多，差异均有统计学意义(均为P<0.05)；与OIR组及OIR+NS组相比，OIR+ Conbercept组小鼠视网膜切片中突破内界膜的血管内皮细胞核数明显减少，为(10.70±2.56)个，差异均有统计学意义(均为P<0.05)；OIR组与OIR+NS组小鼠视网膜切片中突破内界膜的血管内皮细胞核数相比，差异无统计学意义(P>0.05)。

2.2 视网膜铺片结果荧光显微镜下可见，空白对照组小鼠视网膜血管呈放射状分布，可达视网膜边缘，血管分布均匀，无或者较少有无血管区，血管基本发育完全；从视盘中央发出的浅层和深层毛细血管到达锯齿缘。OIR组小鼠可见视网膜血管扩张、迂曲，形成团簇状新生血管，视盘周围出现大片状无灌注区，血管分布紊乱且不均匀；视网膜中周部及靠近无灌注区附近的血管密度明显增高，血管分布紊乱。OIR+NS组小鼠视网膜中周部出现片状无灌注区，可见明显荧光渗漏。OIR+ Conbercept组小鼠视盘周围可见小片状无灌注区，血管分布较均匀，排列较规则，新生血管簇数量少于OIR组(图2)。

图1 各组17 d龄小鼠视网膜切片HE染色(×400) A：空白对照组;B：OIR组;C：OIR+NS组;D：OIR+ Conbercept组。红色箭头示视网膜层间结构紊乱，黑色箭头示突破内界膜的血管内皮细胞核及新生血管。

2.3 Western blot 检测结果Western blot 检测结果显示，与空白对照组相比，OIR组、OIR+NS组及OIR+Conbercept组小鼠视网膜中VEGF蛋白相对表达量均增加(均为P<0.05)；OIR+ Conbercept组小鼠视网膜中VEGF蛋白相对表达量均较OIR组及OIR+NS组减少，差异均有统计学意义(均为P<0.05)；OIR组与OIR+NS组小鼠相比，视网膜中VEGF蛋白的相对表达量差异无统计学意义(P>0.05)。OIR组、OIR+NS组及OIR+ Conbercept组小鼠视网膜中TH蛋白的相对表达量均较空白对照组减小(均为P<0.05)；OIR+ Conbercept组小鼠视网膜中TH蛋白相对表达量均较OIR组及OIR+NS组减少，差异均有统计学意义(均为P<0.05)；OIR组与OIR+NS组相比，视网膜中TH蛋白的相对表达量差异无统计学意义(P>0.05)(图3、表2)。

图3 Western blot检测各组小鼠视网膜中TH、VEGF蛋白表达电泳图 1：OIR组；2：OIR+NS组；3：空白对照组；4：OIR+ Conbercept组。

表2 各组小鼠视网膜中VEGF及TH蛋白的相对表达量

2.4 高效液相色谱仪检测结果空白对照组小鼠视网膜DA含量为(0.051±0.022)μg·g-1， OIR组、 OIR+NS组小鼠视网膜DA含量分别为(0.027±0.008)μg·g-1、(0.026±0.010)μg·g-1，均较空白对照组减少，差异均有统计学意义(均为P<0.05)；OIR+ Conbercept组小鼠视网膜DA含量为(0.016±0.006)μg·g-1，与OIR组及OIR+NS组小鼠视网膜DA含量相比明显减少，差异均有统计学意义(均为P<0.05)；OIR组与OIR+NS组小鼠视网膜DA含量之间差异无统计学意义(P>0.05)。

3 讨论

ROP是一种严重致残性疾病，其特征在于视网膜血管生成异常，纤维组织增生后发展为渗出性牵拉性视网膜脱离。随着早产儿监护、吸氧及治疗的发展，新生儿成活率增加，加之早期眼底筛查技术的完善，ROP的发病率也逐年增加。为模拟ROP，本实验选取高流量吸氧建立OIR模型。因玻璃体内注射抗VEGF药物会进入全身循环，可能影响对侧眼视网膜VEGF含量，所以本实验选取右眼为实验眼[9-10]。本研究结果可见，OIR组小鼠视盘周围可见大片无灌注区，且视网膜血管扩张、迂曲，大量新生血管形成及荧光素渗漏；玻璃体内注射Conbercept后可见新生血管减少，视网膜无血管灌注区减少。有研究表明，氧诱导视网膜病变的神经视网膜障碍可能与OIR诱导DA释放有关，而DA是调节神经视网膜信号和眼轴生长的神经递质，且有大量研究证实了DA在近视的发展过程中起着重要作用[11]。

DA是儿茶酚胺类神经递质，与许多神经系统疾病密切相关。DA是由多巴胺能神经元摄取酪氨酸，由限速酶TH转化为左旋多巴，后经多巴胺脱羧酶转化为DA。而DA的稳定代谢产物为3，4-二羟基苯乙酸(多巴克，DOPAC)[8,12]。 视网膜中DA的唯一来源是无长突细胞的一个特殊亚类，即多巴胺能无长突细胞(DAC)。在小鼠视网膜上大约有500个DAC稀疏且规则地分布。它们的树突和轴突广泛重叠，在内丛状层中形成密集的网络。一些轴突样突起也穿过内核层，在外丛状层形成成簇的精细突起。Spix等[13]在OIR模型中发现，尽管中央视网膜毛细血管明显脱落，但在12 d龄小鼠OIR模型视网膜中DAC的总数没有变化；然而，在17 d龄小鼠OIR模型视网膜中观察到DAC的显著丢失，其中，中央无血管区域的细胞丢失比周围新生血管区域更严重，DAC大量丢失，导致TH免疫反应性降低和视网膜DA水平降低。除DAC外，之前的一项研究报道了OIR大鼠模型中将杆状信号从杆状通路传递到锥体通路的关键中间神经元AII无长突细胞的死亡[14]。此外，与DAC和AII无长突细胞相比，其他无长突细胞、水平细胞、双极细胞和视网膜神经节细胞均不易受到OIR的影响[15-17]。本研究结果显示，OIR组小鼠视网膜中TH蛋白相对表达量下降，与上述文献实验结果相符合。

Conbercept为一种国产新型重组可溶性VEGF受体蛋白，具有多靶点、亲和力强、作用时间长等特点，是治疗ROP的常用药物[18]。Conbercept是VEGFR1的2号决定簇和VEGFR2的3号、4号决定簇与人免疫球蛋白G的Fc段结合形成的人源化重组融合蛋白，大多数的研究都利用体外实验证实Conbercept对新生血管的形成有抑制作用，并且抑制作用优于其他类型的抗VEGF药物[19]。VEGF是具有促血管内皮细胞有丝分裂活性的二聚体糖蛋白。但近年来越来越多的证据表明，VEGF在神经发育、神经保护和成年神经元修复、生存、再生过程中均发挥着非常广泛和复杂的作用[20-21]。VEGF在体内外培养对神经元和胶质细胞具有神经营养和神经保护作用，并能促进神经干细胞的增殖和存活，且认为它的神经保护作用是一种不依赖于其促进血管生成功能的直接作用。有研究表明，VEGF可以减轻多巴胺能神经元的变性损伤，促使纹状体幸存的神经末梢释放的DA增多，从而抑制单胺类神经递质代谢紊乱，改善动物神经功能[22]。Saint-Geniez等[23]曾对表达sFlt1(sFlt1是由mRNA剪接产生的VEGFR1的可溶性形式，是一种有效的VEGF抑制剂)的14 d龄小鼠行视网膜切片观察，结果显示，视网膜内核层和外核层均有显著细胞凋亡；第28天，细胞死亡增加导致内核层和外核层的厚度显著降低；内核层主要由Müller细胞、双极细胞、水平细胞和无长突细胞构成，外核层包含光感受器胞体，电镜下可见多种细胞凋亡的典型征象。

本研究结果证明，Conbercept对ROP新生血管有较好的抑制作用，这与较多文献研究结果一致[19,24-25]。本研究结果显示，在OIR模型中，视网膜VEGF含量明显增加，Conbercept玻璃体内注射5 d后，小鼠视网膜VEGF及TH蛋白的相对表达量均较OIR组及OIR+NS组减少，差异均有统计学意义(均为P<0.05)，说明Conbercept抑制视网膜新生血管产生的同时，进一步影响TH的表达量。本研究高效液相色谱仪检测结果显示，OIR+ Conbercept组小鼠视网膜DA含量与空白对照组、OIR组及OIR+NS组相比，均显著减少(均为P<0.05)，但其作用机制及作用位点尚未明确，可能与DAC的凋亡或其下游蛋白的表达有关[26]。OIR模型小鼠玻璃体内注射Conbercept后视网膜中TH表达及DA含量进一步下降的原因可能为，Conbercept抑制VEGF的生物学作用，使得VEGF的神经营养作用、促进突触增长的作用减弱，具体机制有待进一步研究。本研究中，虽然空白对照组小鼠视网膜中VEGF相对表达量低，但TH蛋白相对表达量及DA含量均较OIR组、OIR+NS组和OIR+ Conbercept组高，我们认为是由于OIR模型受高氧及新生血管破坏视网膜神经分泌功能所致，即使VEGF含量高，也不能使DA分泌量增加。而在正常视网膜中，可能正常生理剂量的VEGF即可保证DA正常分泌。我们在预实验中曾行玻璃体内注射2 μL Conbercept，探索小鼠视网膜DA含量是否与Conbercept含量有关，但小鼠玻璃体容积有限，2 μL Conbercept玻璃体内注射时，显微镜下可以看到有部分Conbercept自注射处流出，5 d后部分小鼠的视网膜切片可见眼球肌化，视网膜厚度变薄甚至无视网膜组织，所以Conbercept注射量是否与DA含量减少呈剂量关系还需进一步实验研究。

综上所述，玻璃体内注射Conbercept可抑制视网膜新生血管生成，使视网膜中VEGF含量降低，在治疗新生血管的同时，亦可使视网膜中TH、DA的相对表达量进一步下降，但其作用机制尚不明确，且是否有剂量相关性还需进一步实验研究。基于VEGF可营养DAC，促进突触分泌，DA对视网膜的神经发育及对近视的抑制有重要作用，所以在临床中怎样避免抗VEGF的副作用，或如何通过调整DA含量来保护抗VEGF治疗后ROP患儿的视网膜功能是非常重要的研究方向，这也是我们下一步研究的重点，本研究为此类临床问题的解决提供了新的思路。