基于生物信息学及网络药理学分析丹皮酚抗瘢痕疙瘩的作用机制

刘丽娜， 杨锋

(南华大学衡阳医学院附属第二医院整形外科，湖南省衡阳市 421001)

瘢痕疙瘩(keloid，KD)是创伤后皮肤及皮下组织异常修复，导致成纤维细胞异常增殖，胶原纤维、细胞外基质过度沉积而形成的一种病理性瘢痕，具有侵袭性和复发性[1-2]。目前，手术切除、化学药物注射治疗、物理治疗以及脂肪干细胞移植等治疗手段虽能在一定程度上抑制KD增生，但存在治疗周期较长、治疗部位局限、不良作用及复发率大等缺陷[3]。生物信息学分析和网络药理学分析是通过数据挖掘、数据整合等方式，将疾病与药物进行相互映射，从而获取核心基因、潜在靶点，为药物靶点治疗带来了新思路。本研究拟运用生物信息学和网络药理学分析的方法对KD和丹皮酚进行整合分析，筛选在KD发病过程中的核心基因、丹皮酚治疗KD的潜在靶标蛋白，建立PPI网络并进行网络拓扑分析、基因功能注释，为丹皮酚治疗KD提供理论依据。

1 资料和方法

1.1 数据资料

KD致病相关基因来自于CTD数据库和GeneCards数据库，丹皮酚直接靶点基因来自于TCMSP数据库和PubChem数据库。GEO数据验证使用的芯片数据来源于GEO数据库中KD数据集，编号为GSE6820，包含36个样本。该数据集基于GPL1521平台。

1.2 筛选侯选靶点和候选基因

在CTD和GeneCards数据库中检索并下载KD致病基因。在TCMSP和PubChem数据库中检索并下载丹皮酚直接靶点基因，将基因名称转化为gene symbol形式，合并两数据库中结果。将KD致病基因及丹皮酚直接靶点分别输入到蛋白质相互作用数据库(STRING：function protein association networks，STRING，https://cn.string-db.org)中，获得蛋白-蛋白相互作用(protein-protein interaction，PPI)文件，导入Cytoscape3.7.1软件中构建PPI网络，运用CytoHubba插件进行分析，筛选出KD候选基因和丹皮酚候选靶点。

1.3 药物-疾病PPI网络构建与分析

将KD候选基因和丹皮酚候选靶点均导入STRING中，并使用Cytoscape软件构建疾病-药物PPI网络图。对候选靶点及候选基因取交集，获取潜在药物靶点，采用STRING数据库和Cytoscape3.7.1软件构建PPI网络。采用CytoHubba插件分析degree值。

1.4 潜在靶点基因的功能注释及数据可视化

通过DIVAD软件(database for annotation，visualization and integrated discovery，https://david.ncifcrf.gov/conversion.jsp)进行基因功能富集(GO)分析和信号通路富集(KEGG)分析。运用Sangerbox生物信息平台进行可视化。采用Cytoscape软件分析GO基因功能、KEGG信号通路与潜在药物靶点间的相互作用。

1.5 GEO芯片数据集潜在靶点验证

下载GSE6820原始数据文件，使用R软件对文件进行合并及标准化。利用平台注释文件对探针进行注释，剔除没有匹配到基因的探针；对于不同探针映射到同一基因，则选取不同探针均值为最终表达值。利用limma包计算基因表达差异的P值和表达Fold Change值，选取P<0.05且|log2FC|>1作为筛选指标，筛选出KD组织中差异性表达基因。

2 结 果

2.1 KD候选基因和丹皮酚候选靶点

CTD数据库和GeneCards数据库中分别获得KD致病基因6 271和534个，取交集获取KD致病相关基因312个。以degree>8(mean degree)为筛选条件，获取KD候选基因143个。

TCMSP数据库和PubChem数据库中分别获得丹皮酚相关基因27和35个，合并后得到丹皮酚直接靶点基因57个。以degree>5(mean degree)为筛选条件，获取KD候选基因29个。

2.2 PPI网络分析

构建的KD候选基因与丹皮酚候选靶点PPI网络(图1)包含个181个节点和2 376条边。

图1 KD候选基因与丹皮酚候选靶点PPI网络图图标的颜色越深代表对应基因的degree值越大。

筛选出潜在药物靶点共11个，分别是核转录因子κB抑制剂(nuclear transcription factor κB inhibitors,NFKBIA)、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)、B细胞淋巴瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)、磷脂酶和张力蛋白同源物(phosphatase and tensin homolog，PTEN)、转化生长因子β1(transforming growth factor-beta 1，TGF-β1)、蛋白质丝氨酸苏氨酸激酶1(protein serine threonine kinase 1,Akt1)、丝裂原活化蛋白激酶1(mitogen-activated protein kinase 1,MAPK1)、白细胞介素-6(Interleukin-6,IL-6)、核转录因子-κB1(nuclear transcription factor-κB1,NF-κB1)、纤维连接蛋白1(fibronectin，FN1)、半胱氨酸蛋白酶3(Caspase-3)，CytoHubba插件分析潜在药物靶点的degree值依次为7、8、3、8、7、10、10、9、7、7、10，并构建潜在药物靶点PPI网络(图2)。

2.3 潜在药物靶点的基因注释及数据可视化分析

以P<0.05为条件，筛选出GO基因功能富集条目共37个、KEGG条目21个。生物过程(BP)条目21个，分子功能(MF)条目9个，细胞定位(CC)条目7个。BP主要富集于负向调节细胞凋亡、正向调节细胞增殖等；MF主要富集于蛋白结合、转录因子结合及酶结合等；CC主要富集于细胞质、细胞核及线粒体等(图3)。KEGG信号通路主要富集于磷脂腺肌醇3激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol 3 kinase/protein kinase B，PI3K/Akt)、缺氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor,HIF-1α)、凋亡等信号通路中(图3)。潜在药物靶点与GO功能和KEGG信号通路之间的相互关系见图4。

图2 潜在药物靶点PPI网络图图标的颜色越深代表对应潜在药物靶点的degree值越大。

图3 潜在药物靶点基因富集分析图A为分子功能(MF)气泡图；B为细胞定位(CC)气泡图；C为生物过程(BP)的气泡图；D为信号通路气泡图。

2.4 作用靶点验证结果

GSE6820数据集进行差异性表达分析后，发现该数据集仅对NFKBIA、Bcl-2、TGF-β1、MAPK1、IL-6、NF-κB1、FN1和Caspase-3这8个靶点进行了检测，以P<0.05且|log2FC|>1为条件，筛选GSE6820中的差异性表达基因，发现NFKBIA、NF-κB1、 TGF-β1符合筛选条件(表1)。

图4 潜在药物靶点与GO功能和KEGG信号通路网络图PA1～PA21表示信号通路；MF1～MF9表示分子功能；BP1～BP21表示生物过程；CC1～CC7表示细胞定位。

表1 作用靶点验证结果

3 讨 论

KD在整形外科中是一类难治性的疾病，由于其反复发作导致无法治愈。目前KD的治疗方式较多，但治疗效果不确切、预后不佳。丹皮酚是一种来自于牡丹干燥根茎中的中药单体成分，来源广泛且提取技术成熟，在肿瘤治疗领域应用相当广泛。丹皮酚可以通过抑制肿瘤细胞增殖、促进肿瘤细胞凋亡、改变肿瘤细胞生存周期、影响肿瘤细胞周围毛细血管的增殖、抑制上皮间质转化等方式起到抗肿瘤的作用[4]。也有研究表明，丹皮酚可以抑制增生性瘢痕的增长[5]。鉴于KD与肿瘤及增生性瘢痕存在相似性，推测丹皮酚可以抑制KD成纤维细胞的过度增殖并促进异常增殖成纤维细胞凋亡。

本文选择CTD和GeneCards数据库获取KD致病基因。CTD数据库可将化学、基因、表型、疾病和暴露因素的毒理学信息联合起来，包含了KD在内的7 200种疾病的基因表达数据。GeneCards是人类基因的综合数据库，也包含有KD致病相关基因的数据信息。选用TCMSP和PubChem数据库获取丹皮酚直接靶标基因。TCMSP数据库包含化学物质、靶点和药物靶点网络，可以获得中药成分对应的各种化学信息等。PubChem是一种化学模组数据库，包含3个子数据库，PubChem BioAssay库用于储存生化实验数据，PubChem Compound库用于存储整理后的化合物化学结构信息，PubChem SubStance用于储存机构和个人上传的化合物原始数据，本研究所需的丹皮酚直接靶点基因来自于PubChem Compound数据库中。靶点验证时所需的数据来自于GEO数据库，该数据库中包含有肿瘤和非肿瘤数据资料，可对疾病的差异性表达基因进行筛选和分析。

本研究采用网络药理学和生物信息学的方法筛选出11个潜在药物靶点，主要富集于PI3K/Akt信号通路和凋亡信号通路。在PI3K/Akt信号通路中，PI3K接受细胞膜外的信号刺激后，可将PIP2磷酸化为PIP3，进一步激活Akt，最终影响下游NF-κB、mTOR及FoXO信号通路[6-8]。PTEN能逆转PIP2-PIP3的磷酸化过程，降低PI3K/Akt信号通路的活性[9]。刘琴等[10]发现，妇科肿瘤疾病中均存在PTEN/PI3K/Akt信号调控的异常激活。陈晴晴等[11]发现PTEN表达下调与肝纤维化相关，通过激活PI3K/Akt信号通路，促进肝纤维化。许帅等[12]发现部分中药可诱导PTEN高表达而治疗糖尿病肾病。综合分析潜在药物靶点与凋亡通路直接的相互关系，丹皮酚调节的是凋亡相关半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶(cysteinyl aspartate specific proteinase，Caspase)依赖性线粒体凋亡相关通路。丹皮酚主要作用靶点为Bcl-2和Caspase-3。Bcl-2分泌的抑凋亡蛋白Bcl-2主要发挥稳定线粒体膜结构、功能完整性的作用[13]。当线粒体膜上Bcl-2的表达下调时，线粒体膜通透性和稳定性改变，促进Cyt-c的释放和钙离子的跨膜流动[14]，诱导凋亡复合体的形成，最终导致Caspase-3参与的细胞凋亡相关程序激活[15]。Caspase-3基因编码的蛋白为Caspase-3，为细胞凋亡过程的主要执行蛋白，通过降解PARP、DFF-45，导致DNA修复抑制并诱导其碎片化，促进细胞凋亡。在肿瘤细胞中，凋亡信号通路常常处于抑制状态，Zhao等[13]发现大鼠结肠癌细胞中IL-6及Bcl-2高表达，抑制癌细胞凋亡。

GEO数据库的验证发现，潜在药物靶点中NFKBIA、NF-κB、TGF-β1在KD成纤维细胞及正常成纤维细胞的表达具有统计学意义，主要富集于NF-κB信号通路中。NF-κB信号通路的激活受多条信号通路的影响，当PI3K/Akt信号通路激活时，NF-κB信号通路可被激活，促进细胞增殖、分化及各种蛋白合成；NF-κB还可以受到多种细胞因子的调控，TNF-α受体相关因子、血管内皮生长因子可激活NF-κB信号通路，促进炎症反应、抑制细胞凋亡、促进毛细血管新生等[16]。

综上所述，丹皮酚主要作用于NFKBIA、mTOR、Bcl-2、PTEN、TGF-β1、Akt1、MAPK1、IL-6、NF-κB1、FN1、Caspase-3，影响PI3K/Akt信号通路、Apopotsis信号通路和NF-κB信号通路来抑制KD的发生发展。