KU60019抑制ATM对HepG2细胞辐射旁效应的调控
2022-06-28颜宇龙万丹婷周洁朱子豪邓蒸蒸黄波
颜宇龙， 万丹婷， 周洁， 朱子豪， 邓蒸蒸， 黄波
(南华大学衡阳医学院公共卫生学院，湖南省衡阳市 421001)
肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是全球范围内第五大常见肿瘤，在中国，肝细胞癌的发病率排在肿瘤发病率中第4位，病死率排第2位，且近80%患者症状晚期才发现[1]。目前肝细胞癌的治疗方法有肝移植、靶向药物治疗、手术切除、放疗和局部消融等。在患者肿瘤细胞进行放疗同时也能对周围正常细胞或组织产生的损伤为辐射旁效应[2](the radiation-induced bystander effect,RIBE)。RIBE主要通过细胞缝隙链接(Gap junction intercellular communication,GJIC)、活化细胞因子参与自噬、外泌体等三大途径发挥损伤作用，能导致基因不稳定、炎症反应、DNA损伤、细胞凋亡、细胞生长异常等生物学效应[3]。共济失调毛细血管扩张症突变(ataxia-telangiectasia mutated,ATM)基因能识别DNA损伤位点，辐射损伤可活化ATM来识别和修复DNA损伤[4]。KU60019是一种ATM激酶特异性的抑制剂，是高度有效的放射增敏剂。本研究探讨ATM在辐射旁效应中的调控作用及机制，为肝细胞癌放疗提供理论基础。
1 材料和方法
1.1 主要试剂
人肝细胞癌细胞(HepG2)由中国军事医学科学院周平坤研究员惠赠。DMEM培养基购自Gibco公司(USA)；MTT、罗丹明B、Giemsa染液购自北京索莱宝科技有限公司；137Cs γ射线生物细胞辐照仪(型号为HXFS-IA)购自中国核动力原设备制造厂。活性氧(reactive oxygen species,ROS)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)试剂盒购自南京建成生物科技有限公司；Annexin V-FITC/PI双染凋亡检测试剂盒购自南京Vazyme生物科技有限公司。
1.2 辐射旁效应细胞模型的构建
137Cs γ射线生物细胞辐照仪照射HepG2细胞，剂量率为133.3 cGy/min，辐照总剂量为8 Gy。通过刺激液模式构建辐射旁效应模型，8 Gy辐照1 h后收集细胞培养液，1 000 r/min离心5 min，收集上清，用0.22 μm过滤头过滤后构成条件培养基，将条件培养基加入到未受辐照细胞中，共同培养1 h。
1.3 实验分组及处理
实验分为空白组(NC组)、辐射旁效应组(ICM组)、辐射旁效应+KU60019组(联合组)及单纯辐照组(IR组)。NC组不做任何处理，新鲜普通培养基培养；ICM组于1.2构成的旁效应培养基中培养；联合组培养液为旁效应培养基中加入KU60019,使含KU60019旁效应培养基的终浓度为7 μmol/L；IR组于新鲜普通培养基培养时单纯8 Gy辐照处理。
1.4 MTT检测细胞存活率
将HepG2细胞以3.0×104个/mL接种于96孔板中，待细胞贴壁，各组实验处理后培养24、48、72 h后，每孔加入10 μL MTT以及90 μL培养基，于37 ℃培养箱中孵育4 h，弃上清，每孔加入110 μL Formazan溶液，室温下振荡仪振荡10 min，酶联免疫检测仪测定490 nm波长处的光密度(OD)，分析各组细胞存活率。
1.5 细胞生长曲线实验检测细胞增殖
将HepG2细胞以5.0×103个/mL接种于24孔板中，各组完成实验处理后，每3天更换相应的培养液，每隔24 h计数一次，连续计数7天。
1.6 细胞内SOD活力、MDA含量、ROS水平的测定
将HepG2细胞以2.0×105个/mL水平接种于6 cm皿中，完成各组处理因素48 h后收集细胞。提取蛋白，酶标仪490 nm处用BCA法测定各处理组样品蛋白的水平。按照试剂盒说明书检测细胞内SOD活力、MDA含量、ROS水平。
1.7 荧光分光光度法检测线粒体膜电位
按1.6方法收集细胞，1 mL预先4 ℃处理的杜氏磷酸盐缓冲液(DPBS)重悬细胞，每管加入1 μL罗丹明B，使溶液质量浓度为100 mg/L，避光孵育0.5 h，离心收集细胞，1 mL DPBS重悬细胞，荧光分光光度计检测各组细胞线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential,MMP)。最佳激发波长488 nm，发射波长为525 nm。
1.8 流式细胞术检测细胞的凋亡
按1.6方法收集细胞，离心去上清，加入100 μL的Binding Buffer悬浮细胞，加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL Propidium Iodide混匀液孵育5 min，最后加400 μL Binding Buffer混匀，1 h内流式细胞仪检测。
1.9 统计学分析
2 结 果
2.1 KU60019浓度的确定
以DMSO作为KU60019溶剂，MTT检测DMSO，1、3、5、7、9 μmol/L KU60019作用于细胞后观察细胞的存活情况。结果表明，DMSO对细胞存活无明显影响，24、48、72 h后，7、9 μmol/L KU60019能明显抑制细胞增殖(P<0.05；图1)，7 μmol/L KU60019对HepG2细胞毒性较9 μmol/L更小，故后续选用7 μmol/L KU60019进行实验。
图1 MTT检测不同浓度KU60019对细胞存活率的影响a为P<0.05,与0 μmol/L组比较。
2.2 KU60019抑制ATM后降低细胞存活率
ICM组、联合组、IR组细胞存活率低于NC组(P<0.05)，联合组、IR组细胞存活率明显低于ICM组(P<0.05；图2)。
图2 KU60019抑制ATM后降低细胞存活率a为P<0.05,与NC组比较;b为P<0.05,与ICM组比较。
2.3 KU60019抑制ATM后降低细胞增殖能力
IR组、联合组细胞从第5天开始生长缓慢，细胞数明显低于NC组和ICM组(P<0.05)；ICM组、联合组、IR组细胞生长能力明显低于NC组(P<0.05；图3)。
图3 KU60019抑制ATM后降低细胞增殖能力a为P<0.05,与NC组比较;b为P<0.05,与ICM组比较。
2.4 KU60019抑制ATM后对细胞内SOD、MDA、ROS的影响
与NC组比较，ICM组、联合组、IR组细胞内SOD活力下降，MDA含量和ROS水平升高(P<0.05)；与ICM组比较，联合组、IR组细胞内SOD活力下降，MDA含量和ROS水平升高(P<0.05；表1)。
表1 KU60019抑制ATM后对细胞内SOD、MDA、ROS的影响
2.5 KU60019抑制ATM后降低细胞线粒体膜电位
与NC组比较，ICM组、联合组、IR组细胞线粒体膜电位降低(P<0.05)；与ICM组比较，联合组、IR组细胞线粒体膜电位降低(P<0.05；图4)。
图4 KU60019抑制ATM后降低线粒体膜电位a为P<0.05,与NC组比较;b为P<0.05,与ICM组比较。
2.6 KU60019抑制ATM后促进细胞凋亡
与NC组比较，ICM组、联合组、IR组细胞凋亡率增加(P<0.05)；与ICM组比较，联合组、IR组细胞凋亡率增加(P<0.05；图5)。
图5 KU60019抑制ATM后促进细胞凋亡a为P<0.05,与NC组比较;b为P<0.05,与ICM组比较。
3 讨 论
目前，放射治疗是肝细胞癌治疗的主要方法之一，肿瘤细胞有不同程度的辐射抗性，肿瘤细胞生长速度快、增殖能力强，其增殖与凋亡失衡是肿瘤细胞抵抗辐射的重要原因[5-6]。本研究结果表明，当未施加任何处理因素时，空白组肝细胞癌细胞增殖能力强，生长速度快，且均高于其他处理组，IR和辐射刺激液作用后能对HepG2细胞存活产生明显抑制。ATM是DNA损伤修复治疗靶点，正常情况下ATM以无活性的二聚体形式存在，当细胞受到辐射损伤时，ATM可活化介导细胞凋亡与增殖等生物学通路，激活细胞周期检查点，进行细胞自我损伤修复或导致凋亡发生[7-8]。本研究发现KU60019作用于HepG2细胞抑制ATM蛋白激酶表达后能明显抑制HepG2细胞存活，且联合组细胞存活率与增殖能力明显低于ICM组。这说明KU60019抑制ATM能降低细胞增殖能力，促进细胞凋亡。
氧化应激的介入可介导辐射旁效应，氧化还原稳态是维持细胞正常增殖的重要因素之一，ATM活化后可以降低体内活性氧水平，激活PI3K/Akt信号通路，增强细胞抗氧化损伤能力[9-10]。黄越等[11]发现组织受到损伤后，ATM被活化，能产生ROS、SOD等副产物，导致组织氧化还原系统失衡，发生氧化应激损伤。本文ICM组与IR组较NC组细胞ROS、MDA含量上升，SOD活力下降；当抑制ATM蛋白激酶表达，联合组较ICM组细胞ROS、MDA含量上升，SOD活力下降，这提示ATM参与此次辐射旁效应氧化损伤过程。
线粒体能调节凋亡信号通路，线粒体内膜含有很多带有负电荷的糖蛋白，这些糖蛋白可引起线粒体膜电位发生变化[12]，从而细胞色素C可随膜电位进入细胞，参与细胞凋亡，介导辐射旁效应早期生物效应[13]。本文ICM组与IR组较NC组细胞凋亡率增加，线粒体膜电位下降，联合组较ICM组细胞凋亡率增加、线粒体膜电位下降。
综上所述，ATM在辐射损伤调控作用中起到不可替代的作用，抑制ATM蛋白激酶表达，能使细胞对辐射旁效应敏感性增加，氧化还原系统失衡，细胞抗氧化损伤能力降低，能阻碍细胞进行自我损伤修复，使细胞增殖受到抑制，发生凋亡。这为提高肝细胞癌细胞的放射敏感性、进一步阐明辐射旁效应的机制提供了基础。
