迷迭香酸对高糖诱导人视网膜血管内皮细胞迁移、凋亡的作用

王化湘， 刘光化， 简唯求， 彭辉灿， 李姣

(1.隆回县人民医院，湖南省邵阳市 422200；2.南华大学衡阳医学院附属第二医院眼科，湖南省衡阳市421001)

糖尿病视网膜病变是目前全世界范围内糖尿病患者最常见的视力损害并发症，其发病机制十分复杂，主要与视网膜血管内皮细胞及新生血管生成有关[1]。研究发现，糖尿病视网膜病变患者存在视网膜血管内皮细胞迁移与凋亡的情况[2]。目前临床对于糖尿病视网膜病变的治疗主要通过手术与药物治疗，但由于个体因素的原因，目前的治疗方法并不能满足全部患者的需求，因此国内外众多学者一直在积极寻找新的治疗策略。迷迭香酸是一种水溶性天然酚酸类化合物，目前的药理学研究表明其有较强的抗氧化能力与抗炎活性[3]，对于抑制微血管生成同样具有一定作用[4]，但目前国内外关于迷迭香酸在视网膜血管内皮细胞凋亡方面的研究未见报道。本研究通过体外实验用高糖培养构建糖尿病视网膜病变的细胞模型，来探讨迷迭香酸对人视网膜血管内皮细胞凋亡的影响。

1 材料和方法

1.1 实验材料

迷迭香酸购自武汉华翔科洁生物技术有限公司；Trizol Reagent总RNA提取试剂盒、反转录试剂盒和实时荧光定量聚合酶链反应试剂盒购自美国英杰公司；AnnexinV-FITC/PI凋亡检测试剂盒购自北京索莱宝生物科技有限公司；PCR基因引物购自上海生工生物工程股份有限公司；ELISA试剂盒购于江苏碧云天有限公司；血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(cysteinyl aspartate specific proteinase-3，Caspase-3)、B淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)、Bcl-2相关蛋白X(Bcl-2-associated X protein，BAX)、β-actin抗体及辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠IgG二抗购自北京博奥森生物技术有限公司；DMEM培养基与胎牛血清购自美国GIBCO公司；人视网膜血管内皮细胞购自上海中科院细胞库。

1.2 细胞培养及分组处理

将解冻后人视网膜血管内皮细胞转移至含1%青霉素、链霉素与10%胎牛血清的DMEM培养基中进行悬浮培养，在5%CO237 ℃恒温条件下传代培养。当细胞处于对数生长期时进行后续试验。取发育良好的人视网膜血管内皮细胞按培养方案分为对照组、迷迭香酸组、高糖组、联合组。对照组在正常培养过程中不进行任何干预，迷迭香酸组在细胞正常培养过程中加入50 μmol/L的迷迭香酸干预，高糖组在细胞正常培养过程中加入25 mmol/L的高糖培养液进行干预[5]，联合组在细胞正常培养过程中加入25 mmol/L的高糖培养液与50 μmol/L的迷迭香酸进行干预。

1.3 Transwell试验

于Transwell小室的上室中加入无血清的DMEM培养基并培养1 h使膜层亲水，随后弃去培养基，上室加入200 μL的人视网膜血管内皮细胞悬液，随后按不同分组向下室加入含有不同成分的培养基，每组设置5组复孔，于培养箱中放置过夜。次日分别对下室细胞进行多聚甲醛固定与0.1%结晶紫染色，室温放置5 min后观察各组细胞迁移状态。

1.4 流式细胞术

将培养后的人视网膜血管内皮细胞悬液1 200 r/min离心5 min后弃去上清液，洗涤2次后通过200目铜筛网过滤细胞，随后用AnnexinV-FITC/PI凋亡检测试剂盒对其进行处理，避光孵育15 min后用流式仪对细胞的凋亡情况进行检测，并使用流式软件CytExpert对细胞凋亡结果进行处理。

1.5 ELISA试验

收集离心后的上清液，参照ELISA检测试剂盒说明书测定各组白细胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、白细胞介素-8(interleukin-8，IL-8)与肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)的含量。

1.6 Western blotting试验

将培养后的人视网膜血管内皮细胞悬液离心后弃去上清液，然后加入RIPA裂解液和PMSF蛋白酶抑制剂提取总蛋白，以BCA法测定样品蛋白的水平，随后以4∶1的比例加入蛋白上样缓冲液沸水加热变性。将提取的总蛋白依次进行上样、SDS-PAGE电泳、5%脱脂奶粉封闭及PVDF膜湿法转膜操作。转膜后分别孵育VEGF、Caspase-3、Bcl-2、BAX及β-actin抗体与相对应的辣根过氧化物酶标记的二抗2 h，以凝胶成像系统进行图形采集，以β-actin为内参蛋白，通过ImageJ图像分析软件对各组人视网膜血管内皮细胞中各因子的相对表达量进行分析。

1.7 实时荧光定量PCR

将处理后收集到的人视网膜血管内皮细胞悬液离心后弃去上清液，通过Trizol Reagent总RNA提取试剂盒进行总RNA提取，随后通过反转录试剂盒将总RNA反转录为cDNA，再通过实时定量聚合酶链反应试剂盒与各细胞因子上下游引物混合离心，随后于PCR仪上进行扩增，循环完成后做溶解曲线。以采集到的荧光信号值(Ct值)进行相对定量分析。引物信息(5′-3′)：VEGF上游引物TCGAGACCCTGGTGGACATC，下游引物CACACAGGACGGCTTGAAGA；Caspase-3上游引物GTCCCACTGTCTGTCT CA，下游引物GAATGTCATCTCGCTCTG；Bcl-2上游引物TGACACGCTTCCCTGGATTGGCAGCCAGAC，下游引物CTGACGCACACCTATTGCAAGCAAGGGTTC；BAX上游引物GAGTGGAAGATGTCCGGCTC，下游引物CCAGGAGGAAGAAGGCTTGG；β-actin上游引物TCAGGTCATCACTATCGGCAAT，下游引物AAAGAAAGGGTGTAAAACGCA。

1.8 统计学处理

2 结 果

2.1 各组人视网膜血管内皮细胞的迁移能力比较

Transwell结果显示，高糖组[(136.5±9.4)个]迁移细胞数量较对照组[(34.3±3.8)个]显著增加(P<0.05)，迷迭香酸组[(29.5±1.6)个]较对照组减少，但差异无显著性(P>0.05)；联合组[(54.6±6.7)个]与迷迭香酸组迁移细胞数量均较高糖组显著减少(P<0.05；图1)。

图1 显微镜下人视网膜血管内皮细胞的迁移状态(0.1%结晶紫染色，50×)

2.2 各组人视网膜血管内皮细胞凋亡情况比较

流式细胞术结果如图2所示，高糖组细胞凋亡水平(51.50%±9.68%)较对照组(15.84%±3.67%)、迷迭香酸组(17.16%±4.52%)、联合组(25.00%±5.24%)显著增加(P<0.05)。

2.3 各组人视网膜血管内皮细胞炎症指标比较

ELISA结果显示，高糖组炎症指标的含量较对照组显著升高；联合组、迷迭香酸组炎症指标的含量较高糖组显著降低(P<0.05；表1)。

图2 各组人视网膜血管内皮细胞凋亡情况

2.4 各组人视网膜血管内皮细胞VEGF与凋亡基因的蛋白表达水平

Western blotting结果如图3所示，与对照组及迷迭香酸组比较，高糖组VEGF、Caspase-3与BAX的蛋白表达量显著升高，Bcl-2表达量显著降低(P<0.05)。与高糖组比较，联合组及迷迭香酸组细胞中VEGF、Caspase-3与BAX的蛋白表达水平显著降低，Bcl-2表达水平显著升高(P<0.05)。

表1 各组细胞炎症指标的水平比较 单位：μg/L

图3 各组细胞中VEGF、BAX、Caspase-3、Bcl-2蛋白水平a为P<0.05，与对照组及迷迭香酸组比较；b为P<0.05，与高糖组比较。

2.5 各组人视网膜血管内皮细胞VEGF与凋亡基因的mRNA表达水平

qRT-PCR结果如图4所示，与对照组及迷迭香酸组比较，高糖组VEGF、Caspase-3与BAX的mRNA表达水平升高，Bcl-2表达水平下降；与高糖组比较，联合组及迷迭香酸组VEGF、Caspase-3、BAX的mRNA表达水平下降，Bcl-2的mRNA水平升高(P<0.05)。

图4 各组细胞中VEGF、Capase-3、BAX、Bcl-2 mRNA表达水平a为P<0.05，与对照组及迷迭香酸组比较；b为P<0.05，与高糖组比较。

3 讨 论

随着社会环境、人口老龄化与人类饮食结构的改变，糖尿病的发病率近年来逐渐上升，目前已成为严重危害人类健康的慢性疾病。研究表明，糖尿病的危害主要是微血管方面的病变[6]，对患者机体多器官造成严重损害，其中对于视力损害最为严重的并发症是糖尿病视网膜病变。糖尿病视网膜病变主要表现为眼部微血管的病变，在疾病发展过程中，人视网膜血管内皮细胞会发生增殖与迁移导致新生血管的生成，同时其氧化-抗氧化系统会出现紊乱，产生大量的活性氧，从而破坏细胞的正常功能，并且机体炎症指标IL-1β、IL-6、TNF-α会过度表达，造成内环境进一步紊乱[7]。如果未能得到及时治疗，患者的视力会加速下降直至完全失去。本研究通过培养暴露于高糖环境的人视网膜血管内皮细胞，模拟糖尿病患者体内高血糖状态[8]，并给予迷迭香酸进行干预，以研究迷迭香酸对人视网膜血管内皮细胞的作用及相关机制。

目前临床上糖尿病视网膜病变的治疗方法包括全身给予改善微循环的药物治疗、玻璃体腔药物注射、视网膜激光光凝以及玻璃体手术治疗[9-11]。VEGF作为一种在糖尿病视网膜病变发生发展过程中关键的调节因子，其拮抗药物通过玻璃体注射治疗糖尿病视网膜病变的疗效同样得到了临床的认可，但存在易导致患者出现视网膜纤维化的缺陷[12]。近些年来，中医药在眼科疾病治疗方面取得了一定的疗效。迷迭香酸是从唇形科植物迷迭香中分离得到的天然水溶性多酚羟基化合物，药理学研究表明，其具有多种药理学功能，如抗氧化、抗炎、抗肿瘤等等，并得到了国内外众多学者的认可[13]。在本研究中，迷迭香酸能明显抑制高糖环境下人视网膜血管内皮细胞的迁移能力，提示迷迭香酸可作为糖尿病视网膜病变的治疗药物。此外，迷迭香酸同样对高糖诱导的人视网膜血管内皮细胞中的炎症反应有明显的抑制作用，进一步说明了迷迭香酸作为糖尿病视网膜病变的治疗药物具有非常广阔的应用潜力。

细胞凋亡又称程序性细胞死亡，是机体内细胞死亡的重要途径[14]，当机体正常的凋亡程序受阻时会引发细胞的过度凋亡，导致相关疾病的产生[15]。在糖尿病性视网膜病变过程中，视网膜血管内皮细胞内出现大量炎性介质，彼此之间形成级联反应共同导致细胞非程序性凋亡[16]。国内外多项研究均证实了高浓度葡萄糖可增加人视网膜血管内皮细胞的细胞凋亡水平[17]。本研究结果显示，高糖环境下人视网膜血管内皮细胞的凋亡细胞数量显著增加，促凋亡基因表达水平上调，与各研究结果一致。同时，本研究结果也显示，当加入迷迭香酸进行干预时，能够明显改善高糖环境下人视网膜血管内皮细胞的凋亡状态，其促凋亡基因表达水平显著下降，抑凋亡基因显著上升。

综上所述，迷迭香酸能够通过抑制人视网膜血管内皮细胞迁移与炎症，从而阻止凋亡进程的发生，降低细胞凋亡率，发挥对人视网膜血管内皮细胞的保护作用，本研究为糖尿病视网膜病变的中药治疗提供了一定的依据。