LDHA对乳腺癌演变的影响及SUMO化修饰

赵雪可，李 威，刘 文，黄泽翎，曹 鸽，梁伟华，曹玉文,4

有氧糖酵解途径是肿瘤细胞包括乳腺癌特征性的代谢方式，多数肿瘤细胞通过增强糖酵解活性和产生大量乳酸及快速生成ATP促进癌细胞的生长和转移[1-4]。乳酸脱氢酶(LDHA)是无氧糖酵解途径中催化丙酮酸转化为乳酸的关键酶。文献报道LDHA依赖性乳酸上调加速了乳腺癌的增殖、迁移和侵袭[5-6]。Subramonian等[7]的研究表明调控LDHA表达和功能与SUMO化修饰密切相关，鼠转移性乳腺癌中SUMO化修饰水平显著上调。本课题组前期应用质谱技术发现人乳腺癌组织中LDHA的SUMO化修饰程度明显降低。本文着重探讨LDHA在乳腺癌变过程中的表达和临床意义，并验证LDHA的SUMO化修饰水平，为后续分析LDHA蛋白SUMO化修饰对乳腺癌发生、发展的影响提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料收集2000年1月～2010年9月石河子大学医学院第一附属医院存档的乳腺癌旁正常组织127例(距癌组织>5 cm)、普通型导管增生97例、导管不典型增生51例、导管原位癌83例、浸润性导管癌359例。手术切除后的新鲜乳腺癌组织和癌旁正常组织各取30例，所有患者均排除术前治疗及伴发严重疾病。患者均签署知情同意书并经石河子大学医学院第一附属医院伦理委员会审批。乳腺癌细胞MDA-MB-231和乳腺正常细胞MCF-10A购自上海复祥公司。

1.2 方法

1.2.1免疫组化 石蜡切片依次二甲苯脱蜡、梯度乙醇脱水、高压微波抗原修复和3%双氧水封闭。滴加LDHA抗体(稀释比1 ∶1 000、Abcam ab52488)孵育过夜，滴加二抗，DAB显色，苏木精复染。免疫组化染色采用EnVision法，由两位资深病理医师采用双盲法进行判读结果。(1)按阳性细胞百分比计分：阳性细胞数<5%为0分，5%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，>75%为4分。(2)按染色强度计分：无着色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。两项得分结果相乘：得分范围0～12分，>4分为高表达组，≤4分为低表达组。

1.2.2Co-IP和Western blot法 乳腺癌组织和癌旁正常乳腺组织或乳腺癌细胞MDA-MB-231和乳腺正常细胞MCF-10A裂解液内加入抗SUMO1(1 ∶30、Abcam ab32058)和抗IgG(1 ∶500、Proteintech b900610)抗体，Protein A/G agarose beads捕获抗原抗体复合物，SDS-PAGE凝胶分离，转移至PVDF膜，滴加抗LDHA(1 ∶5 000、Abcam ab52488)及β-action抗体(北京中杉金桥公司)，然后添加二抗。Image Lab拍照并灰度扫描分析，LDHA与β-action条带灰度比值作为LDHA相对表达量。

1.2.3在线数据库分析LDHA mRNA表达、预测患者预后及筛选SUMO1结合位点 Oncomine(https://www.oncomine.org)和GEPIA(http://gepia.cancer-pku.cn/)数据库分析LDHA mRNA水平。Kaplan-Meier Plotter(http:// kmPlot.com/analysis/)预测乳腺癌患者预后。GPS-SUMO(http://www.uniprot.org/)和SUMO plot Analysis Program(http://www.abgent.com/sumoplot)软件对SUMO化位点进行筛选。

2 结果

2.1 不同乳腺组织中LDHA蛋白的表达免疫组化结果显示，LDHA蛋白在癌旁正常乳腺组织、普通型导管增生、导管不典型增生、导管原位癌和浸润性导管癌的上皮细胞质和细胞核出现不同程度的黄色颗粒(图1)，阳性率分别为26.0%、26.8%、31.4%、54.2%、64.3%(表1)。癌旁正常乳腺组和普通型导管增生组中LDHA表达分别低于导管原位癌和浸润性导管癌组，差异有显著性(P<0.001)，导管不典型增生组中LDHA表达低于浸润性导管癌组，差异有显著性(P<0.001)。

图1 乳腺癌变过程中LDHA蛋白在癌旁正常组织(A)、普通型导管增生(B)、导管不典型增生(C)、导管原位癌(D)和浸润性导管癌(E)中的表达,EnVision法

表1 不同乳腺组织中LDHA蛋白表达[n(%)]

Western blot法检测结果发现，乳腺癌组织和癌旁正常组织中LDHA的相对表达量分别为3.42±0.35、2.21±0.14，两组相比差异有统计学意义(t=-5.527，P=0.005，图2)。乳腺癌细胞和正常细胞中LDHA的相对表达量分别为1.32±0.06、0.82±0.03，两组相比差异有统计学意义(t=-12.915，P<0.001)。

图2 Western blot法检测乳腺癌组织和癌旁正常乳腺组织中LDHA蛋白的表达

数据库挖掘LDHA基因表达，通过Oncomine平台分析389例乳腺癌组织和61例癌旁正常乳腺组织，结果显示LDHA mRNA在乳腺癌组织中的表达量明显高于癌旁正常乳腺组织(P<0.001，图3)。GEPIA在线分析1 085例乳腺癌组织与291例正常乳腺组织，发现乳腺癌中LDHA mRNA水平高于正常乳腺组织，本实验结果与之一致。

图3 Oncomine数据库分析乳腺癌组织和癌旁正常乳腺组织中LDHA mRNA的表达

2.2 LDHA表达与乳腺癌临床病理特征的关系相关性分析结果显示，LDHA蛋白表达与乳腺癌组织学高分级、淋巴结转移、TNM III+IV期和ER阴性相关(P均<0.05，表2)。

表2 LDHA表达与乳腺癌临床病理特征的关系

Kaplan-Meier Plotter数据库预测结果显示，LDHA蛋白表达与乳腺癌患者总生存期(图4A)、无瘤生存期(图4B)及无复发生存期呈负相关(P均<0.05)，与再次进展生存期无相关性(P>0.05)。

图4 A.LDHA与乳腺癌患者总生存期的关系；B.LDHA与乳腺癌患者无瘤生存期的关系

2.3 LDHA蛋白SUMO化修饰Co-IP实验中，使用SUMO1抗体IP之后，乳腺癌组织中沉淀的LDHA蛋白表达量(183 868±4 213)与正常乳腺组织(300 599±18 254)相比下降(图5A)，表明乳腺癌组织中LDHA和SUMO1的结合水平降低。乳腺癌细胞和正常乳腺细胞中沉淀的LDHA蛋白表达量分别为242 817±24 089和186 260±9 260(图5B)，提示乳腺癌细胞中LDHA和SUMO1的相互作用减少。

图5 LDHA蛋白与SUMO1在乳腺癌组织(A)和细胞(B)中的相互作用：Input.阳性对照；IgG.阴性对照

网站预测LDHA与SUMO1结合的赖氨酸位点，SUMOsp2.0显示LDHA的SUMO化修饰位点28个，SUMOplot Analysis Program预测到3个SUMO1位点，依据P<0.05且Score得分越高的原则，共同筛选出LDHA蛋白可信度最高的3个赖氨酸位点(表3)。

表3 LDHA蛋白SUMO化修饰位点

3 讨论

本实验结果显示，LDHA蛋白从正常乳腺→浸润性乳腺癌的癌变过程中，其表达呈逐渐升高趋势，并且LDHA在癌旁正常乳腺组织、普通型导管增生组织中的表达分别低于导管原位癌和浸润性导管癌，在导管不典型增生中的表达明显低于浸润性导管癌，与Western blot法及数据库结果一致，这亦与文献报道LDHA mRNA[8-9]和蛋白在乳腺癌组织和细胞中均上调的结果一致[10]，提示LDHA分子在乳腺癌变阶段发挥促癌作用，推测LDHA在乳腺癌中表达增多，可能与提高LDHA酶的催化作用，从而快速产生更多能量以供癌细胞增殖的机制相关。本实验发现，LDHA高表达与乳腺癌组织学高分级、淋巴结转移、TNM Ⅲ+Ⅳ期和ER阴性相关，也有学者报道，LDHA表达升高的患者Ki-67表达更高、更易发生远处转移且分期更高[8,10-11]，说明LDHA蛋白促进乳腺癌的恶性进展。同时有文献报道当LDHA下调时则抑制了乳腺癌的侵袭、转移能力[9,12-13]，这与LDHA降低则减少乳腺癌细胞的乳酸生成量有关[13]，即通过干扰LDHA表达，降低了乳腺癌细胞的糖酵解从而抑制ErbB2高表达乳腺癌细胞的迁移和侵袭[13]，提示LDHA是发生淋巴结转移和临床晚期的重要恶性表型标志。本实验亦发现LDHA高水平的患者其生存期明显缩短，这与文献报道LDHA阳性者预后较差[10-11]的结果一致，提示LDHA可能是乳腺癌新的潜在预后分子标志物。

LDHA表达和活性受到表观遗传学修饰的调控，SUMO化修饰是目前研究较多的一种翻译后修饰，所谓SUMO化修饰即SUMO分子(最常见的是SUMO1)与底物蛋白特定赖氨酸残基共价连接，调控靶蛋白表达、活性、定位、稳定性等[14]，进而影响肿瘤发生、进展[7,15]。本实验结果显示，正常乳腺组织和乳腺癌组织中LDHA分子与SUMO1相互结合，说明LDHA可以发生SUMO化修饰，Wen等[16]报道前列腺癌细胞中LDHA是SUMO1分子的底物蛋白。本实验发现，正常乳腺中LDHA和SUMO1的结合水平明显高于乳腺癌，与前期质谱结果一致，提示LDHA的SUMO化修饰可能抑制乳腺癌的发生、发展。然而，在鼠乳腺癌细胞中，LDHA的SUMO2/3修饰程度明显低于转移癌组[7]，与本组结果不一致。由此推测，这与LDHA结合不同的SUMO分子、在不同种属以及乳腺癌不同阶段发生的SUMO化修饰有关，需要后续实验验证。本实验检测到LDHA蛋白有3个可信度最高的SUMO化位点K284、K59和K14，提示LDHA可能通过这3个位点与SUMO1结合从而调控LDHA表达和功能。因此，需要后续实验进一步验证这3个位点并探讨对LDHA蛋白的影响。

综上所述，LDHA在乳腺癌变及恶性进展过程中发挥重要的促进作用，其高表达提示预后不良，并且LDHA蛋白发生SUMO化修饰。本实验仍需进一步探讨LDHA蛋白上具体赖氨酸位点发生SUMO化修饰后，对LDHA蛋白表达及乳腺癌发生、发展的影响。